艾克拜爾·艾合麥提，宋玉坤，阿里木江·喀迪爾，努爾博·依熱木拜科，趙 茜，樊 琛，熱衣拉古麗·熱依木，阿布力孜·吾斯曼*
（1.**農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，**烏魯木齊 830052；
2.**農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校沙雅縣分校，**沙雅 842200；
3.徽商生態(tài)牧業(yè)有限公司，**吐魯番 838100）
精液冷凍保存有助于通過人工授精進(jìn)行遺傳改良，消除人工授精應(yīng)用中的地理障礙，保證瀕危品種的保存，從而保護(hù)生物的多樣性[1]。然而，精液冷凍過程會(huì)引起精子的超微結(jié)構(gòu)和生化功能改變，尤其是精子質(zhì)膜和染色質(zhì)受損，精子膜通透性增加，產(chǎn)生活性氧（ROS）并發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（LPO），導(dǎo)致精子活力降低、DNA 斷裂、細(xì)胞凋亡，影響精子的受精能力和早期胚胎的發(fā)育[2]。
原花青素（Proanthocyanidin，PC）是一種來自葡萄籽提取物的多酚生物類黃酮，能有效清除多種ROS和自由基，有效地抑制脂質(zhì)過氧化，使細(xì)胞免于氧化損傷[3]。研究表明，PC 通過其抗氧化活性防止小鼠腦細(xì)胞中乙醇誘導(dǎo)的DNA 損傷[4]，并防止小鼠肝臟細(xì)胞（Fao）中H2O2誘導(dǎo)的DNA 損傷，減少氧化應(yīng)激，并增強(qiáng)硫酸鎳誘導(dǎo)的大鼠睪丸中的精子活力[5]。吐魯番黑羊能夠適應(yīng)吐魯番盆地惡劣的炎熱干旱多風(fēng)沙氣候，且在粗纖維多、木質(zhì)化強(qiáng)的牧草環(huán)境中能快速生長發(fā)育，是**優(yōu)良地方綿羊品種之一[6]。開展吐魯番黑羊精液冷凍保存研究可充分提高其優(yōu)良種公畜的利用率，并為自主培育優(yōu)秀種公羊提供豐富的遺傳資源。因此，本實(shí)驗(yàn)通過在吐魯番黑羊精液冷凍過程中添加不同濃度的PC，研究其對吐魯番黑羊冷凍精液的保護(hù)作用，通過檢測精子的品質(zhì)來證明添加PC 對吐魯番黑羊精液冷凍保存技術(shù)的影響，為今后綿羊精液冷凍技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1.1 主要試劑 原花青素購自源葉生物公司；
葡萄糖、檸檬酸、Tris 購自Sigma 公司；
青霉素鈉、硫酸鏈霉素購自Amresco 公司；
過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性等檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；
姬姆薩染色試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；
花生凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（PNA-FITC）染色試劑盒購自Genmed 公司。
1.2 主要儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀iMark 購自美國Bio-Rad 公司；
離心機(jī)5424 購自德國Eppendorf 公司；
計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA，田園奧瑞，2001532）；
倒置顯微鏡IX71 購自O(shè)lympus 公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 稀釋液配制 基礎(chǔ)稀釋液（I 液）：Tris 3.04 g、無水葡萄糖1.136 g、無水檸檬酸1.554 g、青霉素1 000 IU/mL、鏈霉素1 000 IU/mL，去離子水溶解定容至100 mL，調(diào)整pH 為7.2，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩；A(chǔ)稀釋液（II 液）：Tris 3.0 g 葡萄糖6.0 g、檸檬酸1.7 g、青霉素1000 IU/mL、鏈霉素1 000 IU/mL，去離子水溶解定容至100 mL，調(diào)整pH 為7.2，0.22 μm 濾頭過濾后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?a href="http://www.cnyhmy.com/doc/duizhao/" target="_blank" class="keylink">對照液III 液為法國卡蘇商品化稀釋液OPtidyl（REF：020996，500 mL）。I 液和II 液采用一步法稀釋。先配制基礎(chǔ)液，消毒過濾后再添加20%的卵黃、6%甘油，配制成精液冷凍稀釋液。
1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)羊選取**吐魯番地區(qū)托克遜縣徽商生態(tài)牧業(yè)有限責(zé)任公司的性欲旺盛且繁殖性能高、體型外貌良好、睪丸大小適中，并經(jīng)受過人工假陰道采精調(diào)教的10 只2～3 歲的純種吐魯番黑羊公羊。
1.3.3 精液采集 用假陰道法采集精液，每只公羊每隔1d 采精2 次，采集后20min 內(nèi)到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。選擇精液密度為2.5×109個(gè)/mL 以上，活率0.75 以上的方可用于試驗(yàn)。將檢測合格后至少3 頭公羊的精液混合均勻，以消除個(gè)體差異，放入滅菌試管中備用。
1.3.4 精液處理 精液常規(guī)檢查后，在25℃室溫環(huán)境下用3 種不同稀釋液進(jìn)行6 倍等溫稀釋。隨即將每組平均分成5 份，分別裝在15 mL 滅菌離心管中，在3 種冷凍稀釋液中分別添加0、5、15、25、35 μg/mL 5 種不同濃度的PC，共15 管。將精液與冷凍稀釋液混合均勻后快速用口吸法分裝到0.25 mL 細(xì)管中、封口粉封口，8 層紗布包裹并放入4℃冰箱進(jìn)行平衡，3 h 內(nèi)緩慢降溫至4℃。
1.3.5 精液冷凍及解凍 將平衡后的冷凍細(xì)管置于凍精碼架上，使低溫溫度計(jì)探針與碼架相連并保持同一高度，向泡沫盒中倒入液氮，低溫溫度計(jì)顯示溫度在-80～-120℃，凍精碼架與液氮面距離為3.5 cm，在液氮蒸氣中熏蒸8 min 后，將冷凍細(xì)管投入液氮中，按照組別裝到指型管中進(jìn)行保存。解凍時(shí)，將冷凍細(xì)管投入37℃水浴孵育30 s。
1.3.6 精子活率及運(yùn)動(dòng)速率檢測 精子活率及運(yùn)動(dòng)參數(shù)利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）進(jìn)行檢測，將紅寶石計(jì)數(shù)板置于精子分析儀37℃恒溫載物臺(tái)上預(yù)熱，取10 μL 精液滴在計(jì)數(shù)板中，每個(gè)樣品觀察5 個(gè)視野，自動(dòng)測定精子活率和曲線運(yùn)動(dòng)速率（VCL）、直線運(yùn)動(dòng)速率（VSL）、線性度（LIN）、平均路徑速度（VAP）、頭部側(cè)移幅度（ALH）及振動(dòng)指數(shù)（WOB）等運(yùn)動(dòng)參數(shù)。
1.3.7 精子畸形率檢測 采用姬姆薩染色法評價(jià)精子畸形率。取10 μL 解凍后精液滴于載玻片一端，均勻抹片，自然風(fēng)干，中性福爾馬林固定液固定15 min 后清水沖去固定液，自然風(fēng)干。將抹片反扣裝有吉姆薩染色的染色槽上，使抹片接觸染液，1.5 h 后清水沖去染液，自然風(fēng)干待檢。每個(gè)樣品制作2 個(gè)抹片，每個(gè)抹片觀察200 個(gè)以上精子，并取2 個(gè)抹片的平均值。精子畸形一般分為頭部異常、頸部異常、尾部異常和頂體異常4 類。
精子畸形率=（畸形精子數(shù)/精子總數(shù)）×100%
1.3.8 精子質(zhì)膜完整率檢測 采用Hypo-osmotic swelling test（HOST）方法檢測精子質(zhì)膜的完整性。精子尾部發(fā)生彎曲形成圓環(huán)則為精子質(zhì)膜完整的精子，而質(zhì)膜受損的精子則不會(huì)形成圓環(huán)。將精液樣品解凍后600×g、4℃離心3 min，棄上清，PBS 重復(fù)清洗4 次，取10 μL 精子加入100 μL HOST 液（0.9 g 果糖和0.49 g 檸檬酸鈉溶于100 mL 去離子水）中，37℃混合孵育30 min，取10 μL 滴片，200×相差顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)生彎尾的精子數(shù)，共統(tǒng)計(jì)400 個(gè)精子。
精子質(zhì)膜完整性=彎尾的精子數(shù)／400×100%。
1.3.9 精子頂體完整率 采用花生凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（PNA-FITC）檢測精子頂體完整性，具體操作參照GMS14015.1.1 說明；
400×熒光顯微鏡下拍照觀察并計(jì)數(shù)約200 個(gè)精子，觀測到頂體發(fā)出綠色熒光的即為頂體完整的精子。
1.3.10 精子抗氧化指標(biāo)檢測 CAT、T-AOC、GSH-Px含量嚴(yán)格按照試劑盒說明測定，隨即用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用WPS 2019 進(jìn)行整理，用SPSS 23.0 軟件對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析數(shù)據(jù)顯著性分析，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。
2.1 不同釋液中添加PC 對吐魯番黑羊精液冷凍前后活率、畸形率和運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響 由表1 可知，各組在冷凍前的活率和畸形率差異不顯著。冷凍后，I 液15 μg/mL PC 組精子活率最高73.307%，顯著高于III 液15 μg/mL組，極顯著高于其他13 組。冷凍后，I 液15 μg/mL 組畸形率最低（9.845%），與III 液15 μg/mL 組、III 液25μg/mL 組和I 液5 μg/mL 組、I 液25 μg/mL 組無顯著差異，極顯著高于其他各組。由表2 可知，冷凍后I 液15 μg/mL組的VCL、VSL、LIN、VAP、ALH、WOB等指標(biāo)均極顯著高于其他組。綜合冷凍前后活率、畸形率和運(yùn)動(dòng)參數(shù)等指標(biāo)，I 液5 μg/mL 組、I 液15 μg/mL 組、II 液15 μg/mL 組、III 液15 μg/mL 組、III 液25 μg/mL組精液冷凍效果較好，可作進(jìn)一步檢測以確定最佳冷凍配方。
表1 不同稀釋液添加PC 對精液冷凍前后活率和畸形率的影響
表2 不同稀釋液添加PC 對精液冷凍后運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響
2.2 不同釋液添加PC 對精液冷凍后質(zhì)膜完整性的影響由圖1 可知，I 液15 μg/mL 組的質(zhì)膜完整率極顯著高于I 液5 μg/mL 組，顯著高于II 液15 μg/mL 組、III 液25 μg/mL 組，與III 液15 μg/mL 組無顯著差異。
圖1 PC 凍融后精子質(zhì)膜完整率
2.3 不同釋液添加PC 對精液冷凍后頂體完整性的影響由圖2 可知，I 液15 μg/mL 組頂體完整率顯著高于II液15 μg/mL 組，與其他組無顯著差異。
圖2 PC 凍融后精子頂體完整率
2.4 不同釋液添加PC 對精液冷凍后CAT、GSH-Px、T-AOC 活性的影響 由表3 可知，I 液15 μg/mL 組CAT酶活性顯著高于II 液15 μg/mL 組，與其他3 組無顯著差異。I 液15 μg/mL 組GSH-Px 活性高于III 液15 μg/mL組、III 液25 μg/mL 組、II 液15 μg/mL 組（P＜0.01）和I液5 μg/mL 組（P＜0.05）。I 液15 μg/mL 組T-AOC 含量最高，極顯著顯著高于I 液5 μg/mL 組、II 液15 μg/mL組和III 液15 μg/mL 組（P＜0.01），與III 液25 μg/mL組無顯著差異。
表3 不同釋液添加PC 對精液冷凍后CAT、GSH-Px、T-AOC 活性的影響
精液在冷凍-解凍過程中處于離體狀態(tài)，與外界空氣接觸使精液中氧含量升高而產(chǎn)生過量的ROS，并發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而破壞精子膜的結(jié)構(gòu)與功能完整性，導(dǎo)致精子抗氧化能力、運(yùn)動(dòng)性能、活力下降，從而影響精子的受精能力[7]。因此，在精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的抗氧化劑能及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)部的ROS，提高精子冷凍-解凍過程中的抗氧化能力，有效保護(hù)精子免受脂質(zhì)過氧化損傷[8]。PC 是一種天然的抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以有效清除超氧陰離子自由基（O2-）和羥基自由基（-OH），可以參與花生四烯酸和磷酸的代謝以及蛋白質(zhì)的磷酸化，使脂質(zhì)避免過氧化損傷[9]。
本研究結(jié)果表明，在稀釋液中添加PC 可提高凍融后的吐魯番黑羊精液質(zhì)量和抗氧化能力。線粒體是細(xì)胞的主要能量供應(yīng)場所。線粒體通過氧化磷酸化和ATP的合成作用在維持正常的精子功能和能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[10]。精液冷凍后會(huì)破壞精子的線粒體功能并刺激精子產(chǎn)生過量的ROS，過量ROS 導(dǎo)致精子的抗氧化防御系統(tǒng)失靈，致使精子進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)[11]。ROS 還通過其脂質(zhì)過氧化物MDA 直接氧化精子DNA堿基或與DNA 的共價(jià)鍵，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。然而，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組相比，在精液稀釋液中添加不同濃度的PC 均能顯著提高凍融后精子的運(yùn)動(dòng)速率、活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性，且在I 液中添加15 μg/mL PC 時(shí)效果最好，當(dāng)添加量到達(dá)35 μg/mL 時(shí)精子的活率和畸形率開始降低，與空白對照組之間無顯著差異。這一結(jié)果與Wen[13]等在山羊精液低溫保存中添加葡萄籽原花青素所得結(jié)果類似，但山羊精液低溫保存中所需添加濃度略高，添加最佳濃度為30 μg/mL，當(dāng)超過50 μg/mL 精液品質(zhì)開始降低。呂松潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PC 添加量為10 μg/mL 時(shí)能顯著提高湖羊凍融精子的質(zhì)膜完整率和頂體完整率。另有研究表明，豬精液冷凍稀釋液中添加30 μg/mL 和40 μg/mL 的葡萄籽原花青素可提高凍融后精子頂體完整率、線粒體活性和質(zhì)膜完整率[15]。本研究中，在凍精稀釋液中PC 的添加量為15 μg/mL 時(shí)能極顯著提高精子質(zhì)膜完整率，顯著提高頂體完整率，但當(dāng)添加量到達(dá)35 μg/mL 時(shí)頂體完整率和質(zhì)膜完整率開始降低，說明當(dāng)添加PC 濃度超過一定范圍時(shí)，反而會(huì)破環(huán)精液品質(zhì)。這可能是由于PC在精子脂膜中的作用與膽固醇的作用相似，通過脂膜的調(diào)節(jié)作用使細(xì)胞膜的穩(wěn)定性增強(qiáng)，維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而起到改善凍融精液品質(zhì)的作用[16]。
精液冷凍保存過程中會(huì)產(chǎn)生過量的ROS，ROS 促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，CAT 和GSH-Px 是精漿中內(nèi)源性抗氧化劑，在氧化防御系統(tǒng)中起到清除自由基和維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在I 液中添加15 μg/mL PC 可顯著提高CAT、GSH-Px 活性，在III液中添加25 ug/mL PC 時(shí)T-AOC 含量最高，說明PC在綿羊精液冷凍保存中具有較強(qiáng)的抗氧化作用，這與孫艷青[15]和胡亞美[19]在豬精液冷凍保存和常溫保存中使用PC 的研究結(jié)果相一致。Long 等[17]研究表明PC 有效地防止了玉米赤霉烯酮（ZEN）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，改善了SOD 和GSH-Px 活性，降低了睪丸中MDA 含量。Li[20]等在公豬精液稀釋液中添加PC，精液在保存過程中減少了ROS 的產(chǎn)生，從而改善精子線粒體活性，提高了T-AOC 水平和公豬精子活力。綜上，PC 可以增強(qiáng)抗氧化酶的活性，降低氧化損傷，這應(yīng)該是與PC 含有對抗ROS 和氧化應(yīng)激作用的活性化合物有關(guān)，但PC對綿羊精液冷凍保存起保護(hù)作用的機(jī)制遠(yuǎn)遠(yuǎn)比抗氧化性復(fù)雜，具體的機(jī)理還尚未確切，需通過科學(xué)試驗(yàn)來進(jìn)一步的研究。
本研究結(jié)果表明，在吐魯番黑羊精液冷凍過程中添加PC 能顯著提高冷凍-解凍后的精液質(zhì)量與抗氧化能力，以I 液添加15 μg/mL PC 組效果最佳。
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