金 萍 丁洪流 金曉紅 沈麒亮 范春燕
(1. 蘇州市產品質量監督檢驗院，江蘇 蘇州 215128；
2. 蘇州市食品檢驗檢測中心，江蘇 蘇州 215128)
酶聯免疫吸附法(ELISA)是中國食品安全快速檢測中應用的主要方法，對其研究主要集中于真菌毒素[1-2]、農獸藥殘留[3-6]、食品污染物等[7-10]方面。這類產品多數可以在30 min內完成定量或半定量檢測。免疫檢測研究主要是基于單克隆抗體，但小分子的單克隆抗體制備難度大，假陽性和假陰性率高，價格昂貴，不易保藏。因此，各種類型小分子功能抗體的開發是目前免疫分析研究的重點，其中納米抗體(Nanobody，Nb)具有相對分子量低、對熱以及化學試劑等有較高的耐受能力和易表達改造等優勢[11]。研究擬對納米抗體的特性及其在小分子污染物檢測方面的應用進行綜述，展望納米抗體在生物檢測技術及診斷研究中的發展。
Nb較傳統抗體發現較晚，感染或者免疫過的單峰駱駝的免疫反應會產生普通的抗體IgG及僅有重鏈的抗體(HcAb)，這兩種類型的抗體均有與抗原結合的能力。HcAb只包含一個重鏈可變區(VHH)以及CH2、CH3兩個常規區，其分子量約為90 kDa，比傳統IgG的150 kDa小得多。VHH的分子量只有15 kDa，因此也被稱作Nb。VHH易于進行基因操作獲得較多的單價、雙價和多價Nb，比傳統抗體具有更廣泛的用途[12-15]。目前發現能產生Nb的免疫動物除單峰駱駝外，還有羊駝及鯊魚等。目前，被用作Nb制備的最常用免疫動物為羊駝[16-17]。Nb除具有與原IgG抗體相當的結構穩定性以及與抗原的結合活性外，還具有多項更優良的特點，Nb幾乎完全克服了傳統抗體研發周期長、穩定性差、保存條件嚴格等缺陷；
與人工改造的單鏈抗體片段(scFv)不同，Nb不容易相互黏附聚合成塊，逐漸成為診斷試劑中的新興力量[18-19]，更具研究和應用價值。各抗體結構示意圖如圖1所示。
圖1 抗體結構示意圖Figure 1 Diagram antibody structure
1.1 分子小、親和力強、水溶性好
Nb分子較很小，其產生的空間位阻小，有利于結合一些隱蔽位點[20]。
Nb具有較強的親和力與其結構域直接相關，如圖2所示，VHH的空間結構與常規抗體重鏈可變區(VH)相似，由9個反向平行的β折疊片層通過鏈間氫鍵和二硫鍵連接在一起。Nb存在3個互補決定區(CDR)，相較于VH較長，編號為CDR1、CDR2、CDR3，形成凸起結構，該結構為其抗原結合位點。這3個CDR區域被4個序列相對保守的骨架區(FR)分隔開，編號為FR1、FR2、FR3、FR4[21]。相比于人和小鼠VH中CDR3區9～12個氨基酸[22]，VHH的CDR3區明顯更長，單峰駱駝VHH中CDR3的平均長度約為17個氨基酸，大羊駝為15個氨基酸，甚至有超過25個氨基酸長度的[23-24]。Nb較長的CDR3區域可以形成凸起的環形區域，潛在地增加了互補位構象的多樣性，彌補了CDR區數量較少所引起的抗原結合力不足的缺陷[25]。
圖2 VH和VHH多肽結構示意圖Figure 2 Schematic diagram of VH and VHH polypeptide structure
Nb的序列雖與常規抗體相似，但其具有更好的親水性，原因在于個別位點的差異，VH中多為疏水的氨基酸，但在VHH中變成了親水的氨基酸，使得納米抗體擁有更好的可溶性[26]，具有更好的組織滲透力，能夠進入腫瘤組織內發揮作用，甚至還可以有效地穿透血腦屏障。
1.2 高熱抗性
常規IgG抗體對高溫耐受性差，容易發生不可逆的熱聚合而失活，對保存環境要求較高。相較于常規IgG抗體，Nb大多具有很強的熱抗性，在加熱后能夠重新折疊，仍保存相當的抗體活性，利于長期保存[27]。Liu等[28]在開發赭曲霉毒素A (OTA)的Nb-ELISA方法時，對OTA的納米抗體(Nb15、Nb28、Nb32、Nb36)與OTA的特異性單克隆抗體6H8進行了熱穩定性比較，發現OTA的納米抗體在95 ℃暴露5 min或90 ℃暴露75 min后仍能保持抗原結合活性。Bever等[29]在采用羊駝VHH抗體進行2,2′,4,4′ -四溴二苯醚檢測的開發與利用中發現，高溫條件(95 ℃，10 min)下，羊駝VHH抗體仍保留了>50%的抗體結合活性，而相對應的多克隆抗體活性喪失。
Nb的穩定性與其內部存在的二硫鍵關系密切，FR1和FR3之間存在保守二硫鍵，部分在CDR3和CDR1、CDR3和CDR2之間還有額外二硫鍵[21]，保守二硫鍵以及額外二硫建的存在增加了CDR3區凸形結構的穩定性。Akazawa-Ogawa等[30]研究發現，Nb的耐熱性隨二硫鍵數量的增加而降低。Hagihara等[31]研究表明二硫鍵是一種穩定抗體片段的方法，可通過約束蛋白質的未折疊結構，從而提高折疊結構域的機械穩定性和構象穩定性。
Linden等[32]將抗原特異性的羊駝VHH抗體片段與抗原特異性的小鼠單克隆抗體在特異性、親和力和穩定性方面進行比較發現，相對于抗原特異性的小鼠單克隆抗體，抗原特異性的羊駝VHH片段具有極強的溫度穩定性。1/3的大羊駝VHHs能夠在高達90 ℃的溫度下特異性結合抗原，而全部的小鼠單克隆抗體在該溫度下不起作用。
1.3 化學耐受性
甲醇、丙酮、乙腈和二甲基亞砜等化學試劑是樣品提取中的常用試劑，但常規IgG抗體化學耐受性較差，提取液中化學試劑的殘留會影響后期抗體結合能力，因此，篩選出高化學耐受性的抗體可以簡化前處理過程，減少目標物的損耗，增強檢測靈敏度。
He等[33]對黃曲霉毒素B1(AFB1)納米抗體與特異性單克隆抗體在有機溶劑和高溫下的穩定性進行比較，發現Nb對甲醇、丙酮、乙腈和二甲基亞砜等有機溶劑耐受性較好，并且基于Nb對甲醇的高耐受性，樣品提取物采用不稀釋的納米ELISA分析，靈敏度得到了提高。Zhang等[34]在建立對硫磷VHH-堿性磷酸酶一步法dc-FEIA時發現，對硫磷Nb在40%的甲醇、乙腈以及二甲基亞砜中可保留50%的活性。Zhang等[35]研究發現克百威Nb對甲醇以及乙腈耐受性較好，可耐受50%的甲醇和30%的乙腈。
1.4 低免疫原性
在基因序列層面，駱駝的VHH序列與人VH3序列同源度高[36]，加之Nb的分子量較小，對人體造成的免疫原性較弱。另一方面，Nb沒有傳統IgG抗體的Fc段，可以避免Fc段引起的補體反應[37]。
小分子化合物(<1 000 Da)免疫檢測研究中，先需要與大分子蛋白等載體交聯形成完全抗原，再免疫機體制備多克隆抗體和單克隆抗體。這類傳統抗體分析性能雖然表現優異，但對溫度或有機溶劑等穩定性欠佳，而Nb在溫度耐受性以及化學耐受性方面都具有更明顯的優勢。因此，Nb在小分子免疫檢測領域的應用研究雖起步較晚，但近些年報道逐漸增多，在真菌毒素、農獸藥殘留以及小分子有毒污染物等檢測中多有研究。
2.1 真菌毒素的免疫檢測
受真菌毒素污染的農產品和食品會對人類和動物健康造成嚴重危害，甚至導致死亡。黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)等都屬于真菌毒素。基于單克隆抗體或者多克隆抗體建立的免疫檢測方法在真菌毒素檢測中展現了優良的靈敏度、精確性，同時兼具使用方便的優勢，但傳統抗體的局限限制了其進一步的發展，因此，近些年，對Nb在真菌毒素檢測領域進行了大量研究[38-40]。
季艷偉[41]針對赭曲霉毒素A(OTA)，采用從羊駝天然納米抗體文庫中篩選獲得的OTA抗獨特型Nb，以其作為OTA模擬抗原，建立了ELISA方法；
與化學合成抗原所建立的方法進行比較，靈敏度較以往提高了10倍。吳慧[42]以玉米赤霉稀酮(ZEN)為研究對象，建立了基于噬菌體展示Nb的ELISA檢測方法。通過對試驗中各參數的優化，ZEN的添加回收率可以達到71.7%～102.2%。司睿等[43]從抗微囊藻毒素(MC-LR)噬菌體展示Nb文庫中篩選，獲得編號M110的Nb，以其為基礎構建了水體中MC-LR檢測的間接競爭ELISA，并進行了方法間驗證，與超高效液相色譜—串聯質譜(UPLC-MS/MS)方法的相關系數達0.998。曹冬梅等[44]利用噬菌體展示技術篩選獲得了編號G8DE 抗AFB1納米抗體，將G8的基因與堿性磷酸酶(AP)基因融合，基于Nb-AP融合蛋白構建了一步式ELISA方法，經測定檢出限為2.6 ng/mL。
2.2 農獸藥殘留的免疫檢測
近年來，由于農獸藥工業的快速發展和養殖過程中抗藥性的產生，農獸藥用量逐年攀升，農獸藥殘留超標成為食品安全的“頑疾”。Liu等[45]基于羊駝免疫獲得的VHH C1和包被抗原CBR2-BSA，建立了酶聯免疫吸附試驗，用于谷物中西維因的檢測。基于VHH的酶聯免疫吸附試驗對谷物樣品中西維因進行了簡單提取和稀釋，具有良好的檢測效果。Zhang等[35]通過噬菌體展示技術分離并獲得了抗呋喃丹納米抗體，建立了一種間接競爭ELISA，可用于檢測果蔬樣品中的呋喃丹殘留。結果顯示，采用簡單的樣品前處理程序，省去了有機溶劑的蒸發等環節，可以獲得與超高效液相色譜—質譜/質譜法一致的結果。Zhang等[34]構建了VHH9-堿性磷酸酶融合物(VHH-AP)，并用于建立1/2最大抑制濃度的一步一步直接競爭熒光酶免疫分析(dc-FEIA)，通過對大白菜、黃瓜和生菜樣品的加標驗證以及UPLC-MS/MS的結果確認。結果表明，基于VHH-AP的dc-FEIA是可重復檢測蔬菜樣品中對硫磷殘留的檢測方法。高海崗等[46]從羊駝免疫庫篩選、運用噬菌體展示技術獲得抗孔雀石綠(MG)納米抗體，基于該抗體建立了孔雀石綠膠體金免疫層析檢測試紙條，檢測結果與國標方法一致。
2.3 小分子有毒物質的免疫檢測
Wang等[47]利用駝峰單結構域抗體—堿性磷酸酶融合蛋白(T3-15-AP)一步免疫法測定四溴雙酚A(TBBPA)，環境溫度下，以T3-15-AP為基礎的試驗至少70 d內可觀察到更高的結合穩定性。Fu等[48]將駱駝脂提取的TBBPA特異性納米體與堿性磷酸酶融合獲得雙功能融合蛋白，使TBBPA特異性結合的同時產生檢測信號，建立了一種熒光酶聯免疫吸附法(FELISA)。經驗證，該方法與液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)結果具有良好的相關性，可作為監測TBBPA暴露量的有效方法。姜忍忍[49]利用噬菌體—納米抗體展示技術成功獲得了針對重金屬鎘(Cd)的特異性納米抗體，并初步建立了間接競爭性ELISA免疫檢測法，成功用于水樣重金屬鎘離子的檢測。俞華齊[50]通過篩選納米抗體庫成功獲得了噬菌體抗體Cr-DTPA-VHH4-63，圍繞該納米抗體，建立了檢測重金屬鉻(Cr)的間接競爭性ELISA檢測法。
傳統較成熟的食品小分子污染物檢測產品主要有免疫膠體金試紙條以及免疫試劑盒等，產品多采用傳統IgG抗體，此類抗體熱穩定性較差，要求絕對的冷鏈運輸和貯藏，同時使用周期較短，使用時友好度欠佳。納米抗體作為新型抗體，與傳統的IgG抗體相比，具有更好的特性：納米抗體有更高的熱穩定性，可以大大延長抗體的使用壽命；
納米抗體具有更高的化學耐受性，可以減少前處理中有機溶劑對其的限制；
納米抗體方便進行基因操作，或者加入各種標簽以方便各種檢測應用，這將有望解決免疫檢測中的一大瓶頸——多重檢測。基于納米抗體的諸多優點，在小分子物質免疫檢測領域正慢慢替代傳統抗體。