張 宏， 黃 榮， 姚 博， 張玉娟， 張振粉
(甘肅農業大學草業學院, 草業生態系統教育部重點實驗室， 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)
紫花苜蓿(Medicagosativa)因其產草量高、適口性好和適應性廣等優點，素有“牧草之王”的美譽，是我國西北干旱半干旱地區種植面積最廣的優質多年生豆科牧草之一，也是當今世界上種植最廣泛的豆科牧草之一[1-3]。細菌性病害是導致紫花苜蓿產量損失的主要因素之一，這類致病細菌大多數為革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)，如桃色歐文氏菌(Erwiniapersicina)、成團泛菌(Pantoeaagglomerans)等，它們對紫花苜蓿有致病作用，可引起紫花苜蓿芽細菌性萎蔫病、腐爛病，紫花苜蓿種子細菌性壞死病等[4]。分離于紫花苜蓿的種帶細菌桃色歐文氏菌Cp2，是引起其萎蔫病的主要病原菌[5-6]。病原細菌的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、胞外多糖(Extracellular polysaccharide,EPS)等多種代謝產物是引起植物細菌性病害的重要毒力因子。
LPS也叫內毒素(Endotoxin)，是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，是細菌代謝產物的一種，由類脂A、核心多糖和O-抗原三部分組成[7]，作為一種典型的微生物相關分子模式(Microbe-associated molecular patterns,MAMP)可以誘導動植物產生免疫反應[8]。LPS低濃度時可刺激機體免疫系統，增強固有免疫功能，高濃度時會引起廣泛而強烈的炎癥反應[9]。研究表明，在微生物-植物相互作用中，植物識別LPS后，不僅會直接觸發一些植物防御相關的反應，還會使植物組織對隨后接種的植物病原細菌的反應更迅速[10]。LPS介導細菌與宿主細胞的直接接觸，經LPS前處理可預防野油菜黃單胞菌變種引起的過敏反應[11-12]。促進植物生長的聯合細菌巴西固氮菌(Azospirillumbrasilense) Sp245的LPS特異性地增強了小麥體細胞組織的形態發生活性[13]；
成團泛菌的脂多糖(PantoeaagglomeransLipopolysaccharide,LPSp)是一種低毒安全、純度活性高的免疫增強劑[14]，可以有效調節作物的生長發育進程，會影響幼苗內生細菌的多樣性及數量，促進紫花苜蓿的生長和結瘤[15-16]。然而，關于桃色歐文氏菌Cp2的LPS對紫花苜蓿生長作用的研究鮮有報道。
因此，本試驗以紫花苜蓿‘巨能551’品種為供試材料，測定了不同濃度桃色歐文氏菌脂多糖(ErwiniapersicinaCp2 Lipopolysaccharides,Cp2-LPSe)對紫花苜蓿幼苗生長的影響，闡明內毒素LPS對桃色歐文氏菌Cp2-LPSe濃度的響應機理，以期為Cp2-LPSe的后續研究奠定基礎。
1.1 試驗材料
供試菌株：菌株桃色歐文氏菌Cp2分離于紫花苜蓿種子，由甘肅農業大學草業學院牧草病理實驗室提供。
供試植物種子：以甘肅農業大學牧草種質資源實驗室的‘巨能551’紫花苜蓿種子為供試材料。
供試營養瓊脂/液體培養基(Nutrient agar,NA/NB)[17]用于Cp2菌株的培養和短期保存。
大豆酪蛋白瓊脂培養基(Tryptose soya agar,TSA/TSB)[18]主要用于Cp2的富集培養。
1.2 試驗方法
1.2.1Cp2-LPSe的提取 Cp2-LPSe的提取方法參照熱酚水法[19]，并進行了改進。分別將Cp2菌株接種于3組1 000 mL TSB培養基中培養48 h，11 000 r·min-1離心20 min收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌菌體兩次，12 000 r·min-1離心20 min沉淀稱取濕重。加入5倍體積的去離子水懸起細菌，反復凍融3次，每次液氮5 min，沸水5 min，冰上超聲10 min(26℃，350 w，超5 s，間7 s，70次)。加入等體積90%苯酚溶液于磁力加熱攪拌器68℃震蕩混合30 min，冰上冷卻5 min，4 000 r·min-1離心30 min，收集上層水相，下層酚相加入等量去離子水重復抽提1次，即68℃震蕩混合30 min，冰上冷卻5 min，4 000 r·min-1離心30 min，收集上層水相。合并兩次水相再加苯酚重復抽提1次，即加入等體積90%苯酚溶液于68℃震蕩混合30 min，冰上冷卻5 min，4 000 r·min-1離心30 min，收集上層水相。
收集所有水相置于透析袋中，流水透析24 h，蒸餾水透析24 h，每5～6 h換一次水，到FeCl3檢測無紫色出現為止；
按每100 mL溶液加入4 g聚乙二醇6000固體的比例，將含有水相的透析袋包埋于聚乙二醇6000固體中，將溶液濃縮為原來的1/4。經冷凍干燥得到LPS粗提的樣品，取10 mL的100 mmol·L-1Tris-HCL復溶，加100 μg·mL-1的DNaseⅠ和50 μg·mL-1RNase A，37℃消化過夜，而后加入終濃度為100 μg·mL-1的蛋白酶K，65℃作用2 h，100℃沸水中加熱10 min，冷卻至室溫，12 000 r·min-1離心30 min取上清液，加入2倍體積丙酮，4℃靜置過夜，4℃ 3 500 r·min-1離心15 min,沉淀稱重；
用無菌超純水配成濃度為15～20 mg·mL-1溶液后超離，4℃ 12 000 r·min-1離心2 h，下層冷凍干燥，即得到Cp2-LPSe純品，—20℃保存備用。
1.2.2發芽試驗 前期準備參照《牧草種子檢驗規程GB/T2930.4-2001》[20]，挑選籽粒飽滿、無病蟲害的干凈種子，每個發芽瓶25粒，共5個梯度，每個梯度4個重復，共500粒種子(防止試驗過程中種子遺失，應多準備100粒種子)。生長瓶[21]中加入200 mL蒸餾水和不同濃度的Cp2-LPSe，將生長瓶正面放置發芽床，高溫高壓滅菌鍋(121℃，0.11 Mpa，21 min)滅菌。
發芽試驗在無菌操作臺中，根據預實驗結果確定的濃度，設0 (CK)，0.157，0.314，0.471，0.628 EU·mL-1Cp2-LPSe 5種濃度，每個處理4次重復，每個生長瓶接入25粒種子，在溫度23℃、濕度45%、光照(23 500 lx)18 h+黑暗6 h的組培室進行培養。進一步觀察各個處理下的種子生長狀態，并且統計種子每天的發芽數、發芽勢、發芽率和發芽指數，第14 d的鮮重、干重、苗長、根長、葉綠素和根系形態指標[15]。
1.2.3測定指標 發芽勢(Sprouting potential，GP)(%)=第7 d發芽的種子數/供試種子數×100%；
種子發芽率(Germination rate，GR)(%)=第10 d的發芽的種子數/25×100%；
發芽指數(Germination index，GI)=∑Gt/Dt(Gt:當天的發芽數；
Dt:發芽日數)。
鮮重、干重的測定：從每個生長瓶中隨機取出10株幼苗進行稱重，每個濃度梯度3個重復。在稱鮮重時注意先用濾紙吸取表面多余水分，以精確其幼苗的鮮重。之后將所選取的幼苗放入75℃烘箱烘48 h左右稱量恒重，為其干重。
根長、苗長的測定：從每個發芽瓶中隨機取出4株幼苗，每個濃度梯度3個重復，共12株。從根尖到根基部的長度為根長，而從幼苗的最高部位到幼苗的根基部為苗長。
根系形態指標是將植株根系取出，整理后用根系掃描系統(WinRH120)進行掃描，然后將輸出的圖片使用Win-RHIZO根系分析系統軟件(Regent Istruments Canada Ine)進行分析，分析后分別得出平均根直徑(單個測量植株的所有根的平均直徑，mm)、總根面積(單個測量植株的所有根的面積，cm2)、總根體積(單個測量植株的所有根的體積，cm3)。
葉綠素的測定則采取乙醇法測定，剪取幼苗葉片部分，稱取0.1 g左右的葉片，每個濃度3個重復，將所稱取葉片放入離心管中并加入25 mL95%的乙醇密封保存24 h后，將提取液稀釋一定的倍數，然后用酶標儀(Gen5 CHS3.05)測定波長分別為665，649，470 nm波長下的OD值，代入公式計算葉綠素的含量[22]。葉綠素a的濃度=13.95×OD665—6.88×OD649；
葉綠素b的濃度=24.96×OD649—7.32×OD665；
葉綠素在葉片中的含量(mg·g-1)=色素濃度(mg·L-1)×提取濃度(mL)×稀釋倍數/樣品質量(g)[23]。
1.3 Cp2-LPSe活性
根據黃榮等測定CQ10-LPSp活性得出的標準曲線[16]，將三次測定的樣品的平均值代入到標準曲線中求得Cp2-LPSe活性為0.157 EU·mL-1。
1.4 數據分析
用Excel 2019軟件進行數據的統計整理；
運用SPSS 26.0統計軟件進行差異性分析，比較種子處理和Cp2-LPSe濃度對種子發芽及幼苗生長的影響；
運用Origin pro 2021分析指標間的相關性以及主成分，并繪圖。
2.1 Cp2-LPSe提取(次數)、純化與產率
由表1可知：Cp2在1 000 mL TSB培養基中培養48 h后，收集的平均菌體濕重8.97 g，平均純化的Cp2-LPSe 0.38 g，平均產率為4.27%。
表1 Cp2-LPSe提取次數與產率Table 1 Cp2-LPSe extraction and yield
2.2 不同濃度的Cp2-LPSe對紫花苜蓿種子的發芽的影響
由圖1可知，隨著Cp2-LPSe濃度的升高，各處理下紫花苜蓿種子的發芽率和發芽勢均低于對照，但差異性不顯著，發芽指數隨著Cp2-LPSe濃度的升高也逐漸下降，其中 0.157，0.314，0.471和0.628 EU·mL-1處理比對照分別下降了2.74%，8.26%，11.00%和13.74%，且0.314，0.471和 0.628 EU·mL-1和對照間均存在顯著差異(P<0.05)。表明Cp2-LPSe處理抑制了紫花苜蓿種子的發芽。
圖1 紫花苜蓿在5個不同濃度Cp2-LPSe處理下發芽率、發芽勢和發芽指數Fig.1 Germination rate,Germination potential,and Germination index of alfalfa seeds treated with 5 different concentrations of Cp2-LPSe注：不同小寫字母表示在不同Cp2-LPSe濃度間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different concentrations of Cp2-LPSe at the 0.05 level
2.3 不同濃度的Cp2-LPSe對紫花苜蓿幼苗生長指標的影響
2.3.1不同濃度的Cp2-LPSe對紫花苜蓿幼苗地上、地下鮮重和地上、地下干重的影響 由圖2可知，各Cp2-LPSe濃度下紫花苜蓿的鮮重和干重總體呈先增加后減少的趨勢，其中0.157 EU·mL-1處理較對照總鮮重、總干重分別增加了20.72%，20.22%(P<0.05)；
0.314，0.471和0.628 EU·mL-1處理的總鮮重比對照減少4.54%，6.28%和37.88%，總干重減少4.18%，24.86%和45.36%。表明當Cp2-LPSe的濃度為0.157 EU·mL-1時對紫花苜蓿幼苗的生長起促進作用，大于0.157 EU·mL-1時，對其幼苗的生長會產生抑制作用。
圖2 紫花苜蓿在5個不同濃度Cp2-LPSe處理下的鮮重和干重Fig.2 Fresh weight and dry weight of alfalfa treated with 5 different concentrations of Cp2-LPSe注：不同小寫字母表示在不同Cp2-LPSe濃度間差異顯著(P<0.05)；
不同大寫字母表示在不同Cp2-LPSe濃度間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different concentrations of Cp2-LPSe at the 0.05 level;Different capital letters indicate significant differences between different concentrations of Cp2-LPSe at the 0.05 level
2.3.2不同濃度的Cp2-LPSe對紫花苜蓿幼苗根長、苗長、平均根直徑、總根面積和總根體積的影響 由圖3可知，隨Cp2-LPSe濃度的升高，紫花苜蓿的根長和苗長總體呈現先增加后降低的趨勢，0.157 EU·mL-1處理根長和苗長分別比對照增加了15.31%，15.51%(P<0.05)，0.314，0.471和0.628 EU·mL-1處理分別比對照根長降低了15.91%,29.30%和49.36%(P<0.05)，苗長分別降低了7.41%,6.93%和22.60% (P<0.05)；
在0.157 EU·mL-1處理下總根面積和總根體積較對照分別增加了16.17%和55.64%(P<0.05)，0.314，0.471和0.628 EU·mL-1處理較對照總根面積減少了14.67%，10.76%和25.83%(P<0.05)，總根體積減少了30.35%，42.78%和60.06%(P<0.05)；
平均根直徑隨Cp2-LPSe濃度的升高，各處理比對照分別增加了18.73%，5.85%，17.33%和22.48%(P<0.05)；
表明0.157 EU·mL-1的Cp2-LPSe對紫花苜蓿苗和根的生長產生了促進作用，超過此濃度時，隨著濃度的增大，根系變短變粗，生長受到抑制。
圖3 紫花苜蓿在5個不同濃度Cp2-LPSe處理下根長、苗長、平均根直徑、總根面積和總根體積Fig.3 Root length,plant length,mean root diameter,total root area,and total root volume of alfalfa treated with 5 different concentrations of Cp2-LPSe
2.3.3不同濃度的Cp2-LPSe對紫花苜蓿葉綠素含量的影響 由圖4可知，葉綠素的含量隨著Cp2-LPSe濃度升高呈現先增加后減少的趨勢，0.157 EU·mL-1處理比對照的葉綠素含量上升了5.31%，0.314，0.471和0.628 EU·mL-1處理與對照相比分別下降了7.48%，14.55%，16.59%；
0.314，0.471和0.628 EU·mL-1處理葉綠素含量顯著低于0.157 EU·mL-1處理(P>0.05)。表明0.157 EU·mL-1的Cp2-LPSe對紫花苜蓿幼苗葉綠素的生成有促進作用，超過此濃度會抑制紫花苜蓿幼苗葉綠素的生成。
圖4 紫花苜蓿在5個不同濃度Cp2-LPSe處理下的葉綠素含量Fig.4 Chlorophyll content of alfalfa treated with 5 different concentrations of Cp2-LPSe
2.4 不同濃度的Cp2-LPSe處理下紫花苜蓿各指標間的相關性分析
由圖5可知，對不同濃度的Cp2-LPSe處理下紫花苜蓿各指標間的相關性分析表明，發芽率與發芽勢、發芽指數呈顯著正相關關系(P<0.05)；
地上鮮重、地下鮮重、地下干重、苗長、根總面積和根總體積，與除發芽率、發芽勢、發芽指數、平均根直徑外的其他9個指標呈顯著正相關關系(P<0.05)；
地上干重、根長和葉綠素，與除發芽率、發芽勢以及平均根直徑外的10個指標呈顯著性正相關關系(P<0.05)。平均根直徑與其他12個指標間呈負相關關系。
圖5 不同濃度的Cp2-LPSe各指標間的相關性分析Fig.5 Correlation analysis among different concentrations of Cp2-LPSe indicators注：≥0.9表示顯著相關(P<0.05)Note:≥0.9 indicates a significant correlation (P<0.05)
2.5不同濃度的Cp2-LPSe處理下紫花苜蓿各指標的主成分分析(PCA)
由圖6可知，對不同濃度的Cp2-LPSe處理下紫花苜蓿各指標(苗長、根長、平均根直徑、總根面積和總根體積)主成分分析(Principal component analysis,PCA)結果表明，第一主成分根長(PC1)貢獻率為72.7%，第二主成分苗長(PC2)貢獻率為19.9%，二者貢獻率之和為92.6%，是紫花苜蓿幼苗中各指標組成差異的主要因素，可以很好的解釋各指標的分布情況。0.157EU·mL-1的Cp2-LPSe與其余濃度的Cp2-LPSe沒有重疊部分，相對較離散，此濃度下各指標間都呈正相關性且離散程度較小；
0.471和0.628 EU·mL-1與對照雖沒有重疊，但離散度不高；
0.314，0.471和0.628 EU·mL-1三者相互重疊，離散度不高。表明，在兩個主成分下，0.157 EU·mL-1的Cp2-LPSe對紫花苜蓿幼苗各指標都有很大的影響。
圖6 不同濃度的Cp2-LPSe各指標主成分分析(PCA)Fig.6 Principal component analysis (PCA) of the alfalfa indexes under different concentrations Cp2-LPSe
3.1 Cp2-LPSe的提取純化
不同的LPS提取方法對其的產率影響很大，當前通用的是改良熱酚水法和細菌LPS提取試劑盒法，而熱酚水法適用于大量提取，試劑盒法僅適合少量LPS提取[15]。康潔等分別用改良熱酚水法、超聲波處理法和煮沸法提取大腸桿菌(Escherichiacoli)脂多糖后，發現改良熱酚法提取的大腸桿菌脂多糖濃度高、免疫活性強，是相對比較好的一種提取方法[24]；
楊成蘭等、楊杰等和馮將等用改良的熱酚水法分別提取天鵝源丙型副傷寒沙門氏菌(Swanhirschfeldii)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)和豬源大腸桿菌(Porcine-derivedcoli)的LPS，產率分別為1.48%，2.56%和3.74%[19,25-26]。在本試驗中用改良的熱酚水法提取Cp2-LPSe，平均產率為4.27%，高于上述三個學者所用方法，其原因主要有三點：(1)是在提取時用液氮-沸水凍融Cp2菌體，縮短了凍融所需時間；
(2)是優化程序后的冰上超聲更易使細胞破裂，加速Cp2細胞膜釋放Cp2-LPSe；
(3)是用加熱磁力攪拌器使苯酚能夠充分與懸浮液混合反應；
經過DNase I，RNase A和蛋白酶K處理，去除DNA，RNA和蛋白質，用丙酮沉淀，得到更純凈的LPS。綜上，本試驗改良的熱酚水法提取LPS產率較高，為LPS的提取提供了一種新的方法，也為LPS的體外互作試驗提供了物質基礎。
3.2 Cp2-LPSe對紫花苜蓿幼苗生長的影響
LPS作為革蘭氏陰性細菌細胞膜的主要成分，是一種重要的生物類激發子[27]，在病原菌和植物的相互作用中有著重要的作用，它能夠增強植物預防病害侵染的能力[28]。例如來自不同細菌的LPS制劑在許多植物中誘導防御反應，能夠誘導擬南芥(Arabidopsisthaliana)中活性氧的爆發與NO合成[9,29]；
LPS預處理會提高擬南芥對細菌侵染的抵抗力，LPS預處理也會抑制水稻(Oryzasativa)中相關感病基因的表達[30]。LPS不僅直接誘導植物防御反應，而且在細菌接種時促進或啟動防御反應的早期觸發，例如在LPS處理辣椒葉片后，導致其不能合成抗微生物化合物阿魏酰酪胺和對香豆酰酪胺[31-32]。LPS還可以促進細菌對植物表面的黏附，LPS缺陷突變體活細菌在體外對抗生素和抗菌肽表現出更高的敏感性，從而導致該細菌定殖植物后數量迅速下降[33]。此外，有研究發現成團泛菌LPS會影響紫花苜蓿種子的生長發育，當其濃度為0.267 EU·mL-1時，對紫花苜蓿的生長具有促進作用，濃度升高時則會抑制紫花苜蓿的生長發育[15]。
本試驗證實，0.157 EU·mL-1Cp2-LPSe處理下，紫花苜蓿發芽指標與對照無顯著差異，各生長指標均高于對照，0.157 EU·mL-1Cp2-LPSe使紫花苜蓿地上生物量和地下生物量增加，根系的活力也得到了提高，總生物量較對照提高了9.81%。這與Estefanía等研究發現5 μg·mL-1巴西固氮菌(Azospirillumbrasilense) Sp245 的LPS能夠增加盆栽小麥葉片長度，使小麥快速生長并增加其干重相一致[34]。但當濃度超過0.157 EU·mL-1時，紫花苜蓿幼苗生長隨著Cp2-LPSe濃度的增大而受到抑制，這與黃榮等低濃度成團泛菌CQ10脂多糖促進紫花苜蓿生長，高濃度則抑制紫花苜蓿生長相一致[15]。由此推測LPS對植物的生長具有雙重作用，適宜濃度的LPS促進植物種子的生長發育，而高濃度LPS導致植物激素水平不平衡和活性氧過量而抑制植物種子的生長發育[35-36]。綜上，0.157 EU·mL-1Cp2-LPSe可作為一種植物生長調節劑。
本試驗探究了Cp2-LPSe對紫花苜蓿幼苗生長的影響，結果表明隨著Cp2-LPSe濃度的升高，紫花苜蓿幼苗的總趨勢呈現先上升后下降的趨勢，在0.157 EU·mL-1的Cp2-LPSe的處理下，種子的發芽情況與對照無明顯差異，但幼苗的鮮重、干重、根長、苗長、葉綠素含量以及其他根系指標均高于對照；
表明該處理可以促進紫花苜蓿幼苗的生長，使紫花苜蓿生物量提高了9.81%。本研究為Cp2-LPSe作為一種植物生長調節劑的開發提供理論依據與實踐基礎。