侯 甜，秦雅芝，張 妍，溫國琛，戚孟春，董 偉
華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河北 唐山063210
糖尿病會(huì)影響骨代謝，損害細(xì)胞功能，導(dǎo)致骨質(zhì)流失、骨的微觀結(jié)構(gòu)改變［1］。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是糖尿病慢性并發(fā)癥和骨質(zhì)量惡化的一種機(jī)制［2］。骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)是一個(gè)協(xié)同過程，涉及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互作用。AGEs可以劑量依賴性的方式抑制成骨細(xì)胞特異性基因Runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix（OSX）的表達(dá)，也可通過抑制核因子κB受體活化因子配體/核因子κB受體活化因子信號(hào)傳導(dǎo)來抑制破骨細(xì)胞分化［3］。另有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖可抑制MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化并誘導(dǎo)其凋亡［4,5］。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，但糖尿病微環(huán)境中骨細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚不清楚，且糖尿病性骨質(zhì)疏松癥（DOP）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，有待進(jìn)一步探索。
環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PΚA）是經(jīng)典的細(xì)胞信號(hào)途徑之一。cAMP通過與PΚA的調(diào)節(jié)亞基R結(jié)合來激活PΚA，進(jìn)而磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），以激活下游轉(zhuǎn)錄過程［6］。通過cAMP/PΚA/CREB途徑激活RUNX2可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［7］。因此，通過激活cAMP/PΚA/CREB信號(hào)途徑調(diào)節(jié)DOP患者成骨分化可能是一種潛在的分子機(jī)制。
特立帕肽是一種用于治療骨質(zhì)疏松癥的合成代謝藥物，可治療男性骨質(zhì)疏松，糖皮質(zhì)激素治療有關(guān)的骨質(zhì)疏松癥以及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等［8,9］。但關(guān)于其治療DOP患者的相關(guān)研究報(bào)道較少且多為動(dòng)物模型研究，關(guān)于特立帕肽發(fā)揮作用的細(xì)胞分子學(xué)機(jī)制層面的研究還未有確切詳盡的闡述。因此，本研究探討特立帕肽在高糖微環(huán)境下通過激活cAMP/PΚA/CREB信號(hào)途徑調(diào)節(jié)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化中的分子機(jī)制，對特立帕肽治療DOP具有重要意義。
1.1 材料
細(xì)胞MC3T3-E1（中科院上海細(xì)胞庫）；
α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（BI）；
H-89（MedChemExpress）；
堿性磷酸酶（ALP）顯色試劑盒、DAPI（碧云天）；
ALP活性試劑盒（南京建成生物工程研究所）；
鬼筆環(huán)肽、曲拉通TritonX-100（Sigma）；
茜素紅染色液（雷根生物）；
PCR試劑盒（Abclonal）。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1細(xì)胞接種在細(xì)胞瓶中，用含有10%FBS、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基，在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，當(dāng)密度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化下來，即可傳代。用10 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為5 組：（1）正常糖（NG）組：給予葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的培養(yǎng)基；
（2）NG+特立帕肽組：在葡萄糖濃度為5.5 mmol/L培養(yǎng)基中加入10 nmol/L 特立帕肽；
（3）高糖(HG)組：給予葡萄糖濃度為25 mmol/L的培養(yǎng)基；
（4）HG+特立帕肽組：在葡萄糖濃度為25 mmol/L培養(yǎng)基中加入10 nmol/L特立帕肽；
（5）HG+特立帕肽+PΚA抑制劑組：在葡萄糖濃度為25 mmol/L培養(yǎng)基中加入10 nmol/L 特立帕肽以及通路抑制劑20 μmol/L H-89。
1.2.2 細(xì)胞活性檢測 將MC3T3-E1細(xì)胞密度調(diào)整至2×103/孔，將細(xì)胞懸液接種至96孔板，細(xì)胞貼壁后棄掉原培養(yǎng)基，加入按1.2.1分組新配制的100μL培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，隨后向每孔內(nèi)加入10μLCCΚ-8溶液，在培養(yǎng)箱中放置1 h，采用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞吸光度值A(chǔ)450nm。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.3 細(xì)胞內(nèi)cAMP水平測定 將MC3T3-E1細(xì)胞以2×105/孔的細(xì)胞密度置于24孔板中，細(xì)胞貼壁后棄掉原培養(yǎng)基按1.2.1分組換液，24 h后按ELISA試劑盒操作步驟處理細(xì)胞，檢測各組細(xì)胞cAMP水平。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.4 ALP染色和活性分析 將細(xì)胞以4×103/孔的密度接種至48孔板內(nèi)過夜生長，按1.2.1分組將細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，棄細(xì)胞上清液，PBS洗滌各孔，4%多聚甲醛固定30 min后，再用PBS洗滌各孔，按操作步驟加入ALP染色試劑盒中的染色液，隨后進(jìn)行孵育。顯色后在倒置顯微鏡下觀察拍照。采用活性檢測試劑盒測定各組細(xì)胞的ALP活性，再根據(jù)試劑盒提供的計(jì)算方式進(jìn)行計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.5 茜素紅染色分析 細(xì)胞在48孔板內(nèi)以4×103/孔的密度過夜生長，按1.2.1分組將各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后。在室溫下用染色試劑盒中的固定液固定15 min，PBS洗滌各孔，滴加茜素紅染液對礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行染色，染色時(shí)間30 min，用蒸餾水洗去染色液，光鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)生成情況并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image J軟件分析茜素紅結(jié)節(jié)陽性區(qū)域占總區(qū)域的百分比表示。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.6 熒光染色檢測細(xì)胞骨架 將細(xì)胞爬片提前放置于6孔板中，每孔滴加1 mL細(xì)胞懸液，在細(xì)胞貼壁后按1.2.1中的實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行換液，培養(yǎng)24 h后，輕柔吸去爬片上的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗爬片，在室溫下4%多聚甲醛固定30 min，PBS再次清洗爬片后，用0.5%Triton X-100透化15 min，PBS清洗，每張爬片滴加鬼筆環(huán)肽染液200μL，黑暗環(huán)境下孵育1 h，PBS輕柔沖洗3次，再加入DAPI染液對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，室溫下避光5 min。使用熒光顯微鏡捕獲圖像。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.7 Real-time PCR檢測 將MC3T3-E1細(xì)胞懸液滴加至6孔板中，細(xì)胞貼壁后棄掉原培養(yǎng)基，按1.2.1實(shí)驗(yàn)分組加入對應(yīng)的培養(yǎng)液，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后按照RNA提取試劑盒（簡石生物）操作步驟提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，使用2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal）試劑盒，按照操作說明用StepOnePlus 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行Real-time PCR檢測。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并以β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)中采用的引物序列如表1，數(shù)據(jù)使用2-△△CT法進(jìn)行分析。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間均數(shù)的比較，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的比較
5組MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，CCΚ-8法結(jié)果顯示，NG組、NG+特立帕肽組、HG組、HG+特立帕肽組、HG+特立帕肽+H-89組MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。
圖1 CCΚ-8法檢測不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖水平Fig.1 Proliferation of the cells detected by CCK-8 assay at different time points.NG:Normal glucose;HG:High glucose.
2.2 MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)cAMP水平變化
與NG組相比，NG+特立帕肽組的cAMP水平顯著升高（P＜0.05），HG組cAMP水平降低（P＜0.05）。同樣，在特立帕肽的處理下，HG+特立帕肽組的cAMP水平與HG組比較顯著上調(diào)（P＜0.05）。與HG+特立帕肽組相比，HG+特立帕肽+H-89組cAMP水平下降（P＜0.05，圖2）。
圖2 特立帕肽處理MC3T3-El細(xì)胞后cAMP水平變化Fig.2 Changes in cAMP levels in the cells after teriparatide treatment.*P＜0.05 vs NG(normal glucose),#P＜0.05 vs HG(high glucose),&P＜0.05 vs HG+teriparatide.
2.3 各組MC3T3-El細(xì)胞內(nèi)ALP染色及活性的變化
ALP染色程度及活性檢測結(jié)果顯示，NG+特立帕肽組ALP 活性高于NG 組（P＜0.05），HG 組低于NG組（P＜0.05）。HG+特立帕肽組ALP 活性高于HG 組（P＜0.05），HG+特立帕肽+H-89組低于HG+特立帕肽組（P＜0.05，圖3）。
圖3 特立帕肽處理后MC3T3-El內(nèi)ALP染色及活性變化Fig.3 ALP staining of the cells and changes in ALP activity after teriparatide treatment.A:ALP staining.B:Activity of ALP.*P＜0.05 vs NG,#P＜0.05 vs HG,&P＜0.05 vs HG+teriparatide.
2.4 各組MC3T3-El細(xì)胞內(nèi)礦化結(jié)節(jié)的變化
茜素紅染色結(jié)果顯示，與NG組相比，NG+特立帕肽組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，面積增多（P＜0.05）；
HG組礦化結(jié)節(jié)面積則減少（P＜0.05）。與HG組相比，HG+特立帕肽組礦化結(jié)節(jié)面積增多（P＜0.05）。與HG+特立帕肽組相比，HG+特立帕肽+H-89組礦化結(jié)節(jié)面積則減少（P＜0.05，圖4）。
圖4 特立帕肽處理后MC3T3-El內(nèi)礦化結(jié)節(jié)的變化Fig.4 Changes of the area of mineralized nodules after teriparatide treatment.A:Alizarin red staining.B:Area of mineralized nodules.*P＜0.05 vs NG,#P＜0.05 vs HG,&P＜0.05 vs HG+teriparatide.
2.5 各組MC3T3-El細(xì)胞細(xì)胞骨架清晰度的變化
鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，與NG組相比，NG+特立帕肽組顯示MC3T3-El細(xì)胞呈多角形或梭形，細(xì)胞伸展良好，鋪展范圍大，細(xì)胞骨架走形清晰；
HG組較NG組，細(xì)胞伸展情況差，鋪展范圍小，內(nèi)部骨架結(jié)構(gòu)排列紊亂。特立帕肽加入后，可觀察到HG+特立帕肽組的鋪展情況及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有所提升，較HG組良好。HG+特立帕肽+H-89組較HG+特立帕肽組細(xì)胞鋪展較差，內(nèi)部骨架結(jié)構(gòu)排列紊亂（圖5）。
圖5 特立帕肽處理后MC3T3-El內(nèi)細(xì)胞骨架變化Fig.5 Changes of cytoskeleton staining after teriparatide treatment.
2.6 Real-time PCR 檢測通路及成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)
與NG組相比，NG+特立帕肽組PΚA、CREB水平升高（P＜0.05）；
HG組PΚA、CREB水平降低（P＜0.05）。與HG組相比，HG+特立帕肽組PΚA、CREB水平升高（P＜0.05）。與HG+特立帕肽組相比，HG+特立帕肽+H-89組PΚA、CREB水平降低（P＜0.05）。
在MC3T3-E1細(xì)胞中檢測了成骨細(xì)胞特異性基因RUNX2和Osx的mRNA表達(dá)水平顯示，與NG組相比，NG+特立帕肽組RUNX2和Osx水平升高（P＜0.05）；
HG組RUNX2和Osx水平降低（P＜0.05）。與HG組相比，HG+特立帕肽組RUNX2 和Osx 水平升高（P＜0.05）。與HG+特立帕肽組相比，HG+特立帕肽+H-89 組RUNX2和Osx水平降低（P＜0.05，圖6）。
圖6 Real-time PCR檢測PΚA、CREB、RUNX2和Osx mRNA表達(dá)Fig.6 Detection of PKA,CREB,RUNX2 and Osx mRNA expressions by real-time PCR.*P＜0.05 vs NG,#P＜0.05 vs HG,&P＜0.05 vs HG+teriparatide.
隨著年齡的增長和生活方式的改變，糖尿病的患病人數(shù)越來越多，特別是AGEs的積累，大大增加了患者DOP的發(fā)病率［10,11］。有研究指出，DOP 的發(fā)病機(jī)制涉及高葡萄糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧引發(fā)高水平的氧化應(yīng)激，造成骨代謝失衡，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化活性，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，可顯著改善DOP 骨流失癥狀［12,13］。另有研究表示糖尿病患者中RUNX2的表達(dá)下調(diào)與AGEs的形成相關(guān)，進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞分化［14］。此外，成骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架主要是由微絲、微管、中間纖維等構(gòu)成，對維持細(xì)胞形態(tài)及成骨分化都具有重要意義［15］。因此本研究將細(xì)胞骨架視為成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能做一指標(biāo)進(jìn)行分析。本研究在兩種不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)MC3T3-E1 細(xì)胞，HG 組細(xì)胞骨架清晰程度及ALP 活性、礦化結(jié)節(jié)檢測，Real-time PCR中成骨基因RUNX2、Osx表達(dá)水平等各指標(biāo)結(jié)果相較于NG組都有所下降，證實(shí)了高糖微環(huán)境對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的抑制作用，這與Xia等［4］關(guān)于高糖條件下抑制成骨細(xì)胞分化的研究結(jié)果一致。
有研究顯示特立帕肽可用于治療絕經(jīng)后、男性和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥［16-19］。特立帕肽與其他治療藥物相比，對于改善骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度效果更佳，可有效提升患者生活質(zhì)量［20］。近期研究發(fā)現(xiàn)特立帕肽增加了2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥患者股骨頸的骨礦物質(zhì)密度［21］。特立帕肽和低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)相結(jié)合可增加糖尿病模型大鼠的骨密度［22］。現(xiàn)有研究中關(guān)于特立帕肽發(fā)揮作用的細(xì)胞分子學(xué)機(jī)制層面的研究還未有確切詳盡的闡述。通過目前的研究發(fā)現(xiàn)，推測特立帕肽調(diào)節(jié)高糖微環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化可能是DOP的藥物防治方法之一。本研究在高糖微環(huán)境下加入藥物特立帕肽進(jìn)行干預(yù)，與HG組細(xì)胞骨架清晰程度、ALP活性、礦化結(jié)節(jié)檢測及Real-time PCR 中成骨基因RUNX2、Osx表達(dá)水平相比較，HG+特立帕肽組結(jié)果顯示，特立帕肽能夠提升MC3T3-E1細(xì)胞骨架清晰度，增強(qiáng)ALP 活性、礦化水平，升高成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、Osx的表達(dá)。各項(xiàng)研究結(jié)果說明特立帕肽能夠緩解高糖微環(huán)境對MC3T3-E1成骨分化的抑制作用。
cAMP信號(hào)通路是經(jīng)典的細(xì)胞信號(hào)通路之一，能夠參與調(diào)控多種細(xì)胞分化、增殖、凋亡的基因轉(zhuǎn)錄過程，更是介導(dǎo)甲狀旁腺激素對骨吸收合成代謝作用的主要調(diào)節(jié)途徑［16,23,24］。因此，cAMP信號(hào)通路引起人們的廣泛關(guān)注。低頻脈沖電磁場可通過cAMP/PΚA信號(hào)通路促進(jìn)大鼠顱骨成骨細(xì)胞成骨分化［25］。另有研究指出，具有3D多孔表面的羥基磷灰石復(fù)合聚醚醚酮樣品可通過cAMP/PΚA途徑調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中RUNX2的表達(dá)，在早期促進(jìn)骨形成［26］。有研究指出激活的cAMP/PΚA/CREB信號(hào)通路在加速間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起主導(dǎo)作用［27］。RUNX2 和Osx 是關(guān)于成骨方面的轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞中特異性地以高水平表達(dá)。一方面，RUNX2可以通過其下游基因Osx影響如ALP的成骨分化指標(biāo)，從而促進(jìn)骨形成［28］。另一方面，在高葡萄糖條件下加入未羧化骨鈣素后，G蛋白偶聯(lián)受體C類第6組A亞型/cAMP/PΚA/AMPΚ通路被激活，RUNX2和Osx表達(dá)增加，可促進(jìn)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化［29］。然而，特立帕肽與cAMP/PΚA/CREB通路之間的調(diào)控及其與MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化在高糖微環(huán)境下的作用關(guān)系，尚缺乏研究。因此，本研究假設(shè)特立帕肽能通過激活cAMP/PΚA/CREB信號(hào)途徑來調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化過程。本研究在高糖微環(huán)境下加入特立帕肽后結(jié)果顯示，HG+特立帕肽組胞內(nèi)第二信使cAMP水平相較于HG組有所升高，而其下游的通路相關(guān)基因PΚA、CREB表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，HG+特立帕肽組的成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、Osx表達(dá)較HG組亦呈上升趨勢，細(xì)胞骨架清晰程度，ALP活性、礦化水平也有所升高。這意味著特立帕肽能夠通過激活cAMP/PΚA/CREB信號(hào)途徑來調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化過程。為了進(jìn)一步觀察高糖微環(huán)境下特立帕肽調(diào)控成骨分化的分子學(xué)機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中加入20 μmol/L通路抑制劑H-89干擾信號(hào)傳導(dǎo)，結(jié)果顯示，HG+特立帕肽組較HG+特立帕肽+H-89組的cAMP水平有所下降，Real-time PCR檢測的下游基因PΚA、CREB以及成骨分化相關(guān)基因RUNX2、Osx的表達(dá)亦隨之下降，細(xì)胞骨架清晰程度，ALP活性、礦化水平同樣受到抑制。這提示在高糖微環(huán)境下MC3T3-E1的成骨分化過程中，cAMP/PΚA/CREB 信號(hào)途徑參與其中。同時(shí)，特立帕肽可能是通過激活cAMP/PΚA/CREB 信號(hào)途徑來發(fā)揮其減輕高糖微環(huán)境下對成骨分化的抑制作用。
綜上所述，高糖微環(huán)境下，MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力受到抑制，同時(shí)cAMP水平變化及相關(guān)基因PΚA、CREB、RUNX2、Osx的表達(dá)變化進(jìn)一步確定特立帕肽可能是通過調(diào)控cAMP/PΚA/CREB信號(hào)通路緩解高糖微環(huán)境對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的抑制作用。本研究結(jié)果為深入闡明特立帕肽在高糖微環(huán)境下對MC3T3-E1成骨分化的分子學(xué)機(jī)制提供了新穎的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對更好地了解及預(yù)防治療DOP具有一定的參考意義。但DOP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，特立帕肽在高糖微環(huán)境下激活cAMP/PΚA/CREB信號(hào)通路的過程中與其他信號(hào)通路之間存在何種關(guān)聯(lián)，仍有待進(jìn)一步研究。
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