隋心意，趙小剛，毛 欣，李亞靈，溫祥珍
（山西農業大學園藝學院，山西太谷 030801）
bHLH轉錄因子是廣泛存在于動物、植物中的轉錄因子超家族，因其含有‘螺旋-環-螺旋’結構域而得名[1]。bHLH結構域由50～60個氨基酸組成，包括N端的堿性區(Basic region)和C端HLH區(Helix Loop Helix)[2]。其中N端的堿性區域由10～15個氨基酸組成，植物中50%以上的堿性氨基酸區含有高度保守的H5-E9-R13(His5-Glu9-Arg13)序列，該序列通過和特定DNA的順式作用元件結合激發基因轉錄；
HLH區域主要由40個左右的疏水性氨基酸組成，有利于HLH區域二聚體的形成和蛋白質二級結構的穩定[3-4]。依據進化關系、基因功能、與DNA的結合模式，動物中bHLH轉錄因子被分為 6個組(A、B、C、D、E、F)，45個家族[5]。與動物相比，植物的bHLH蛋白較少，大多數植物bHLH蛋白在動物家族分類中屬于B組[6]。目前在擬南芥中鑒定出了162個bHLH家族轉錄因子，與水稻中的bHLH轉錄因子一起被分成了25個亞家族[7-9]；
將水稻中的165個轉錄因子分為22個亞家族[9]，將擬南芥中161個轉錄因子分為21個亞家族[10]；
PIRES等[11]利用對來源于藻類和陸生植物的500多個bHLH蛋白的分析，將植物bHLH蛋白分為26個亞家族。隨著全基因組測序技術的發展，越來越多物種中的bHLH轉錄因子正在被鑒定出來。
在擬南芥中的大量研究表明，bHLH轉錄因子參與了形態建成、生長發育、抗逆反應、信號轉導和次生代謝等多種生物學過程[2,12]，比如PIF4參與調控擬南芥下胚軸的伸長過程[13]，GL3和EGL3基因控制根表皮的細胞分化[14]，EMBRYO1基因控制胚胎發育[15]，DYTl控制絨氈層的分化和發育[16]，SPATULA基因控制雌蕊的發育[17]；
同時有研究表明AtbHLH112對抗鹽、抗旱和抗滲透脅迫有正調控作用，但抑制根系發育[18-19]，OsHLH013和OsHLH016調控花青素的生物合成，PIF3和PIF4在光敏色素信號傳導中起調控作用[13,20]。在水稻的大量研究中表明bHLH轉錄因子在氣孔發育、腋芽原基形成、胚乳發育、種皮顏色、鐵元素吸收利用、耐鹽性和抗旱性方便也發揮著非常重要的作用。
生菜(Lactuca sativa L.)又名葉用萵苣，為菊科菊苣屬一年生草本植物，富含維生素C、維生素E、葉酸、多酚、膳食纖維、生育酚和類胡蘿卜素等營養物質，是日常生活不可或缺的蔬菜之一[21]。隨著生菜全基因組數據的公布，有必要對生菜bHLH家族基因進行全基因組挖掘和全面、系統分析。因此本研究計劃使用生物信息學的方法，從基因組水平上對生菜bHLH家族的蛋白特性、保守域結構、內含子與外顯子數量、motif分布和功能分化等方面進行研究，以期為生菜bHLH家族基因的克隆、功能解析提供理論基礎。
1.1 數據來源
從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中下載生菜基因組數據和蛋白組數據，通過Pfam(http://pfam.xfam.org/)數據庫中下載bHLH結構域的隱馬氏模型（登錄號為：PF00010）。利用HMMER3.0軟件，以隱馬氏模型文件PF00010對生菜蛋白組數據進行搜索，獲得生菜中含有bHLH結構域的候選蛋白家族成員的蛋白序列。用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)數據庫比對得到的蛋白序列，將無bHLH結構域的序列剔除，確定最終候選基因。
1.2 生菜bHLH蛋白的特性分析
通過ExPASy ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)預測bHLH蛋白氨基酸序列的基本信息，包括氨基酸數量、相對分子量、等電點、疏水性和不穩定性等理化性質。通過在線軟件Cell Ploc 2.0進行亞細胞定位預測(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)；
通過在線軟件THHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜結構分布和數量的預測。
1.3 生菜bHLH蛋白的保守域序列分析
利用序列分析軟件DNAMAN 5.0和在線軟件WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)對生菜bHLH蛋白的保守結構域分析。
1.4 生菜bHLH基因基序預測分析
將生菜bHLH家族的蛋白序列提交到在線網站MEME 4.11.4(http://web.mit.edu/meme_v4.11.4/share/doc/overview.html)進行motif預測分析，搜索基序設置為10，基序長度介于6～50之間，導出meme.xml結果文件。將生菜bHLH基因家族每個成員的CDS序列和其對應的基因組序列進行比對，利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線軟件進行內含子和外顯子圖譜的繪制。
1.5 生菜bHLH基因的進化分析
將最終獲得的135個生菜bHLH轉錄因子用Clustal**行比對，序列比對的結果用MEGA 7.0的NJ法(Neighbor Joining)構建系統發育樹，其中檢驗參數為Bootrap 1000次，模式設置為Poisson model，缺口設置為pair gap deletion。將制作好的進化樹導出，利用ITOL網站進行美化和豐富顏色(https://itol.embl.de/)。
2.1 生菜bHLH基因家族成員鑒定
從Pfam數據庫中下載bHLH家族的隱馬氏模型文件（Pfam碼PF00010），搜索生菜的全基因組蛋白數據庫，共得到163條bHLH類似基因；
用SMART數據庫和hammer網站結構域分析工具鑒定得到的蛋白序列，檢查序列缺失、去除冗余，最終獲得135條bHLH序列。利用expasy在線程序對生菜bHLH蛋白的理化性質進行分析，bHLH蛋白特性分析表明，最長的bHLH蛋白有685個蛋白質殘基，而最短的只有162個蛋白質殘基；
它們的等電點分布在0.63～9.51之間，其中有92個酸性蛋白，43個堿性蛋白；
相對分子量在17843.82～75409.15 Da之間；
不穩定指數分布在32.5～76.39之間，其中有123個蛋白的不穩定系數大于40，說明大部分bHLH蛋白為不穩定蛋白；
135個蛋白的疏水性指數均小于0，為親水性蛋白。cell plot的預測表明有100個蛋白屬于細胞核蛋白，是生菜bHLH家族中數目最多的一部分，有16個蛋白定位于葉綠體，有3個蛋白定位于細胞質，有1個蛋白定位于內質網，有1個蛋白定位于細胞膜；
有1個蛋白定位于線粒體。跨膜結構域分析表明，有134個蛋白無跨膜結構域，有1個蛋白有1個跨膜結構域。但目前這些轉錄因子還未被定位于染色體上。
2.2 生菜bHLH基因保守域的鑒定和分析
使用DNAMAN 5.0對135個生菜bHLH蛋白結構域進行鑒定和分析，并用WebLogo 3獲得生菜bHLH蛋白的結構域序列標簽。分析發現135個生菜bHLH基因保守域基本由50個氨基酸組成，最長為53個氨基酸，最短為43個氨基酸；
該保守域由N端堿性結構域和C端HLH結構域組成；
其中N端堿性結構域由10～15個氨基酸組成，該區域富含堿性氨基酸精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)和酸性氨基酸谷氨酸(E)，谷氨酸可以和DNA的大溝結合。DNAMAN分析表明有103條bHLH序列同時在9位點和12位點同時為E和R，該序列組成可以結合E-Box，有59條bHLH序列同時在5位點、9位點和13位點同時為H、E和R，主要有結合G-Box的功能。C端的HLH結構域的α螺旋富含疏水性氨基酸纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)，其中第23位點的L高度保守，這對維持bHLH蛋白二級結構的穩定有重要作用（圖1、圖2）。
圖1 生菜bHLH結構域的氨基酸序列比對
圖2 生菜bHLH轉錄因子家族的保守結構域
2.3 生菜bHLH轉錄因子家族進化分析
為了研究生菜bHLH家族成員間的進化關系，利用MEGA7.0對135個蛋白的序列進行進化樹分析，結果表明135個bHLH基因被分為10個亞家族（圖3），其中第Ⅷ、Ⅳ和Ⅶ亞家族的bHLH蛋白成員最多，分別包含43、27和15個bHLH蛋白；
第Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅱ、Ⅹ亞家族的bHLH蛋白成員為5～10個；
而第Ⅴ亞家族的成員最少，只含有1個bHLH蛋白。
圖3 生菜中bHLH蛋白家族的系統進化樹
2.4 生菜bHLH蛋白的保守基序確定
為了進一步研究生菜中bHLH蛋白質結構的多樣性，通過MEME在線軟件對135個bHLH蛋白質進行了保守基序分析，搜索參數設置為50，共獲得10條保守基序。由圖4可知，135個bHLH蛋白含有2～4個基序，相同家族的bHLH蛋白傾向于有相同的基序，不同的家族間bHLH蛋白基序數量和類型存在差異，推測正是由于這些特異motif的存在導致了bHLH家族基因功能的分化。但不同的家族均包含基礎基序motif 1和motif 2，在Inter Pro Scan中這兩個基序被注釋為Helix-loop-helix DNA-binding domain。在同一家族間內根據motif的差異和基因長度的不同劃分為不同的亞家族，一些基序僅存在于特定基因中，這些基序可能有助于形成這些基因的特定功能。其中motif 3特異分布于Ⅷ亞家族，該基序被注釋為Basic helix-loophelix leucine zipper transcription factor；
motif 4分布于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅹ六個亞家族；
motif 5特異分布于Ⅱ亞家族；
motif 6特異分布于Ⅷ亞家族；
motif 7分布于Ⅶ和Ⅷ兩個亞家族；
motif 8特異分布于Ⅷ亞家族；
motif 9特異分布于Ⅳ亞家族；
motif 10特異分布于Ⅹ亞家族，motif 4-10在Inter Pro Scan中均被注釋為未知結構。
2.5 生菜bHLH基因的外顯子和內含子結構分析
基因家族各成員的基因結構往往呈現多樣性，其中內含子和外顯子的數量是基因家族進化過程中的重要標志，本研究根據生菜基因組信息獲取了每一個基因的CDS序列信息，并繪制了外顯子—內含子基因結構圖，結果顯示生菜bHLH基因家族內含子數目變化差異較大，介于0～10之間，且內含子的數量在不同的家族間差異較大。由圖5可知，生菜bHLH基因家族分為內含子富集和內含子缺失2類，其中XP_023753528.1、XP_023733363.1、XP_023736226.1、XP_023750890.1、XP_023742628.1、PLY63858.1、PLY992 56.1、XP_023753746.1、XP_023751742.1、PLY91151.1、PLY63479.1、 PLY77525.1、 XP_023737733.1、 XP_023748410.1、PLY66263.1無內含子，PLY67254.1、XP_023746624.1、 XP_023736955.1、 XP_023737512.1、PLY62526.1、XP_023748593.1、XP_023735519.1、XP_023756084.1、XP_023750458.1、XP_023762189.1 僅 1個內含子，以上成員均屬于內含子缺失組；
PLY86498.1、XP_023767110.1含10個內含子（占比1.5%）；
XP_023754083.1、XP_023759112.1含9個內含子（占比1.5%），PLY73746.1、PLY96464.1含8個內含子（占比 1.5%），XP_023756964.1、XP_023748571.1、XP_023748493.1、 PLY67087.1、 PLY74352.1、 XP_023767039.1、 XP_023771981.1、 PLY62734.1、 XP_023736669.1、 XP_023746595.1、 XP_023751248.1、PLY79054.1含7個內含子（占比8.9%），含6個內含子的bHLH基因18個（占比13.3%），含5個內含子的bHLH基因15個（占比13.3%），以上成員均屬內含子富集組。其中含有2個內含子的bHLH基因高達25個，所占成員總數最多，占比18.5%。
圖5 生菜bHLH家族基因外顯子與內含子基因結構分布
植物bHLH蛋白參與抗逆、生長發育、生物合成及信號傳導等生理生化過程[22-23]。目前已從一些植物如擬南芥[8]、水稻[9]、人參[24]、西瓜[25]、茶樹[26]、葡萄[27]、蘋果[28]等分別鑒定出162、167、169、96、120、110、188個bHLH蛋白，但生菜bHLH家族的研究鮮見報道。本研究基于生菜全基因組數據，利用生物信息學的手段鑒定了生菜bHLH轉錄因子家族，并且對它們的理化性質、保守結構域、基因結構和系統進化和等情況進行了詳細的分析。
通過驗證，去除冗余，共鑒定到135個bHLH蛋白。這些bHLH蛋白的蛋白質殘基介于162～685之間，它們的等電點分布在0.63～9.51之間，相對分子量在17843.82～75409.15之間；
不穩定指數分布在32.5～76.39之間。這135個蛋白包括100個細胞核蛋白，16個葉綠體蛋白，3個細胞質蛋白，1個內質網蛋白，1個細胞膜蛋白，1個線粒體蛋白；
其中僅有1個蛋白有跨膜結構域。
生菜bHLH蛋白bHLH保守結構域由兩部分組成，堿性氨基酸區和HLH區。堿性氨基酸區位于N端，HLH區位于C端[7,29-30]。堿性氨基酸區含有高度保守的His5-Glu9-Arg13序列，第10位和第12位的Arg也高度保守，而HLH區第23位和第55位的Leu高度保守，且保守位點與西瓜[25]、蓮[31]和芒果[32]bHLH蛋白的分析結果相似。135個生菜bHLH蛋白中的103個具有E-box的結合功能，59個具有結合G-box的結合功能，該結果與擬南芥(60.54%)和水稻(56.89%)[9]的分析結果相似。
聚類分析表明，135個bHLH蛋白被劃分為10個亞家族，共獲得10條保守基序。由圖可知，135個bHLH蛋白含有2～4個基序，相同家族的bHLH蛋白傾向于有相同的基序，不同的家族間bHLH蛋白基序數量和類型存在差異，推測正是由于這些特異motif的存在導致了bHLH家族基因功能的分化。外顯子—內含子基因結構圖，結果顯示生菜bHLH基因家族內含子數目變化差異較大，介于0～10之間，且內含子的數量在不同的家族間差異較大。
本研究在生菜全基因組中共鑒定出135個bHLH家族蛋白，共發掘出10條保守基序，其中基序motif 1和motif 2是生菜bHLH家族成員均包含的保守基序，為今后生菜bHLH家族蛋白的研究提供了基礎。但本研究僅對生菜bHLH蛋白進行了功能預測，其具體功能還需進一步驗證。
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