彭伯陽，白瑞琴，呂艷芳，范旭東，胡月軍，呂美葉
（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學園藝與植物保護學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010011；
2.蒙草生態(tài)環(huán)境集團（股份）有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；
3.呼和浩特市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；
4.赤峰市林西縣農(nóng)牧局蔬菜站，內(nèi)蒙古林西 025250；
5.土默特左旗鄉(xiāng)村振興統(tǒng)籌發(fā)展中心，內(nèi)蒙古土默特左旗 010100）
百合，花型端莊、莖稈筆直、雅致清幽、寓意含蓄，是盆栽、切花和裝飾環(huán)境的名貴花卉[1-2]，具有極佳的觀賞價值并兼顧藥用與食用。早在唐代，先民就將百合作為藥用植物使用，而后百合逐漸作為食材開始鮮食并烹調(diào)。隨著食用百合產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，百合逐步成為日常保健與食用的特色花卉[3]。沂水百合是近年來興起的食用百合品種，花色豐富，綜合抗性較強，易于規(guī)模化種植與管理，鱗片口感脆爽回甘，是一種功能全面，集食用、藥用與園林綠化于一身的花卉產(chǎn)品[4]。2016年國內(nèi)種植面積達到近萬畝，鱗莖銷售革新了農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，為從業(yè)者帶來了可觀的經(jīng)濟收入；
繁多的加工手段也刺激了民營經(jīng)濟，有力地促進了鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)匯[5]。與他品種相比，食用百合品種N82、N136 花色純正、花器官大、鱗片厚實、鱗莖質(zhì)量高、觀賞性更強，規(guī)模化種植該類品種能獲取更高的經(jīng)濟利益，可有效提升從業(yè)者的生產(chǎn)積極性。
植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種日趨完善的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)，具有大規(guī)模生產(chǎn)和集中化管理的特點，符合當前農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨勢[6]。百合多個器官均可作為外植體進行組培快繁，其中鱗莖是最常用的培養(yǎng)對象[7]。對外植體進行培養(yǎng)的過程中，添加外源植物生長調(diào)節(jié)劑對培養(yǎng)至關(guān)重要，決定著培養(yǎng)周期的快慢和誘導植物組織與器官形成的方向[8]。
隨著市場對沂水食用百合的普遍認可，其產(chǎn)量逐年遞增。但常規(guī)繁殖方式生產(chǎn)周期長，易受外界環(huán)境因素影響，并且還會誘發(fā)品種退化、優(yōu)質(zhì)性狀分離、毒素不斷積累等不利狀況[9]。通過建立其離體快繁體系，能有效解決常規(guī)繁殖過程中存在的諸多問題，豐富與促進地區(qū)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟發(fā)展，不僅能夠為花卉生產(chǎn)者帶來致富新途徑，還能夠為食用百合在內(nèi)蒙古地區(qū)規(guī)模化生產(chǎn)、集約化管理提供相關(guān)的技術(shù)指導與幫助。本試驗通過對食用百合進行離體培養(yǎng)，建立快繁體系，旨在縮短其繁殖周期、實現(xiàn)大量擴繁、解決生產(chǎn)難題。
1.1 試驗材料
供試材料為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學引種馴化的沂水食用百合品種N82 和N136，選出飽滿厚實，無損傷、直徑在3 cm 以上的健康鱗莖，以其鱗片作為外植體。
1.2 試驗方法
1.2.1 培養(yǎng)方式
以MS 培養(yǎng)基作為基礎，配制過程中添加7 g/L瓊脂粉、30 g 蔗糖，將pH 值調(diào)至5.8±0.2。后續(xù)根據(jù)不同時期的試驗需要添加不同組合的植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA、TDZ、NAA、2，4-D、IBA）。配制完成后，在121 ℃條件下高溫滅菌20 min 后常溫散熱。溫度為（25±2）℃，光照時間控制在16 h/d 以上，光強為3 000 lx。
1.2.2 外植體消毒
將鱗莖用清水沖洗，并將鱗片剝離成單片放入1%KMnO4溶液中浸泡并振蕩20 min，后用清水沖洗干凈再轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中。先使用75%乙醇消毒30 s，再分別用1%、3%、5%NaClO 消毒10、15 min，然后用無菌水漂洗，并吸干殘留水。選取鱗片內(nèi)層中下部區(qū)域，將其切割為0.5 cm×0.5 cm 的方塊，以備接種。設6 個處理，每個處理接種30 塊，3 次重復，共10 瓶。15 d 后計算相關(guān)指標。
1.2.3 不定芽的誘導培養(yǎng)
將消毒完畢并切分好的鱗片分別接種到含有不同濃度配比的6-BA（0.1、0.5、1.0 mg/L）和2，4-D（0.5、1.0、2.0 mg/L）培養(yǎng)基中。設9 個處理，MS 培養(yǎng)基為空白對照，每個處理接種30 塊，3 次重復，共10 瓶。30 d 后計算相關(guān)指標。
1.2.4 不定芽的增殖培養(yǎng)
選擇初代培養(yǎng)生長出的2 cm 以上的健壯不定芽（將芽叢切割成單個芽體）接種到含有不同濃度配比的TDZ（0.1、0.2、0.3 mg/L）和NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）培養(yǎng)基中。設9 個處理，MS 培養(yǎng)基為空白對照，每個處理接種30 個不定芽，3 次重復，共10 瓶。30 d 后計算相關(guān)指標。
1.2.5 不定芽的生根培養(yǎng)
選擇3 cm 以上且挺拔健壯的不定芽（將芽叢切割成單個芽體）分別接種到含有NAA（0.5、1.0、2.0 mg/L）、IBA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和AC（0.1、0.3、0.5 g/L）培養(yǎng)基中。設9 個處理，每個處理接種30 個不定芽，3 次重復，共10 瓶。30 d 后計算相關(guān)指標。
1.2.6 煉苗移栽
選取5 cm 以上且根系生長良好的組培苗，將瓶口封口膜摘去，煉苗3 d。隨后取出組培苗，用清水清洗根系上殘留的培養(yǎng)基，快速移栽至攪拌均勻并滅菌的基質(zhì)中。基質(zhì)成分配比為草炭土∶珍珠巖=1∶1、草炭土∶河沙=1∶1 和草炭土∶珍珠巖∶河沙=1∶1∶1，純草碳土基質(zhì)為空白對照。共設4 個處理，每處理移栽15 盆，每盆栽種1 株組培苗。30 d 后計算成活率。
1.3 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019 軟件分析整理，利用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析，各處理以P＜0.05 表示顯著性差異。
2.1 消毒處理對鱗片滅菌效果的影響
由表1 可知，隨著消毒劑濃度的提高與消毒時間的延長，N82 和N136 外植體的污染率下降，死亡率攀升。處理6 兩個品種外植體的污染率均最低，但死亡率分別高達43.30%和50.00%。處理1 兩個品種外植體的死亡率均最低，但污染率分別高達66.70%和56.70%。可見，這兩種情況下，均導致N82和N136 外植體成活率下降。綜合考慮污染率與死亡率的因素，處理3 品種N82 和N136 的外植體成活率最高，分別為63.30%和66.70%。因此，兩種食用百合外植體最優(yōu)消毒滅菌方法均為75%乙醇消毒30 s 后用3%NaClO 溶液處理10 min。
表1 不同消毒處理對N82 和N136 外植體的污染率和死亡率
2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽誘導的影響
由表2 可知，當6-BA 濃度一定時，隨著2，4-D濃度的增加，品種N82 外植體誘導率持續(xù)下降；
當2，4-D 濃度一定時，隨著6-BA 濃度的增加，品種N82 誘導率呈上升趨勢，說明低濃度2，4-D 與較高濃度6-BA 對品種N82 外植體不定芽誘導均有促進作用。處理3 的誘導率最高，為90.00%，與其他處理差異顯著（P＜0.05），新生不定芽長勢良好，挺拔健壯，葉片肥厚（圖1）；
處理2 的誘導率為76.70%；
對照（CK）與處理7 的誘導率最低，分別為13.30%和6.70%，且幼芽低矮瘦弱，顏色淡綠。因此，品種N82最優(yōu)不定芽誘導培養(yǎng)基為0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+MS。
圖1 品種N82 對照（CK）與處理3 不定芽誘導情況
表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對品種N82 不定芽誘導的影響
由表3 可知，當6-BA 濃度一定時，隨著NAA濃度的增加，品種N136 外植體不定芽誘導率呈先上升后下降的趨勢；
當NAA 濃度一定時，隨著6-BA濃度的增加，品種N136 外植體不定芽誘導率呈上升趨勢，說明較高濃度NAA 與較高濃度6-BA 對品種N136 外植體不定芽誘導有促進作用。處理6 誘導率最高，為93.30%，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），且不定芽生長旺盛，葉片數(shù)量多且厚實，顏色深綠（圖2）；
處理5 與處理3 的誘導率分別為76.70%和70.00%；
對照（CK）與處理7 誘導率最低，僅為20.00%，且幼芽低矮纖細，葉片窄小，顏色淡綠。因此，品種N136 最優(yōu)不定芽誘導培養(yǎng)基為1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+MS。
圖2 品種N136 對照（CK）與處理6 不定芽誘導情況
表3 植物生長調(diào)節(jié)劑對品種N136 不定芽誘導的影響
2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽增殖的影響
由表4 可知，當NAA 濃度一定時，隨著TDZ 濃度的增加，品種N82 不定芽增殖系數(shù)呈上升趨勢；
當TDZ 濃度一定時，隨著NAA 濃度的增加，品種N82 不定芽增殖系數(shù)呈先增大后減小的趨勢。處理6 的增殖系數(shù)最大，為5.66，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），芽叢長勢蔥郁茂密，新生葉片數(shù)量多且顏色深綠（圖3）；
處理5 與處理9 的增殖系數(shù)分別為4.86 和5.06，增殖效果次于處理6；
對照（CK）與處理1 的增殖系數(shù)僅為1.33 和2.10，增殖效果最差，且芽叢長勢稀疏萎靡，新生葉片少，色澤淡綠，小部分失綠枯萎。因此，品種N82 最優(yōu)不定芽增殖培養(yǎng)基為0.3 mg/L NAA+0.3 mg/L TDZ+MS。
圖3 品種N82 對照（CK）與處理6 不定芽增殖情況
表4 植物生長調(diào)節(jié)劑對品種N82 和N136 不定芽增殖的影響
當NAA 濃度為0.1、0.5 mg/L 時，隨著TDZ 濃度的增加，品種N136 不定芽增殖系數(shù)先增大后減小；
當NAA 濃度為0.3 mg/L 時，隨著TDZ 濃度的增加，品種N136 不定芽增殖系數(shù)呈增大趨勢。當TDZ濃度為0.1、0.2 mg/L 時，隨著NAA 濃度的增大，增殖系數(shù)持續(xù)的增大；
當TDZ 濃度為0.3 mg/L 時，隨著NAA 濃度的增大，增殖系數(shù)先增大后減小。處理8 的不定芽增殖系數(shù)最高，為5.86，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），且芽叢長勢挺拔茂密，新生葉片寬厚健康，顏色深綠（圖4）；
處理6 和處理9 的增殖系數(shù)分別為5.20 和4.80，不定芽增殖效果稍差于處理8；
對照（CK）與處理1 的增殖系數(shù)最低，僅為1.26和1.93，增殖效果不理想，芽叢長勢低矮稀疏，新生葉片數(shù)量少且部分發(fā)黃卷曲。因此，品種N136 最優(yōu)不定芽增殖培養(yǎng)基為0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L TDZ+MS。
圖4 品種N136 對照（CK）與處理8 不定芽增殖情況
2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽生根的影響
由表5 可知，品種N82 的組培苗在3 種誘導條件下，均能生根且生根效果良好。在NAA 處理下，隨著其濃度的增加，生根率呈上升趨勢，平均生根數(shù)先減少后增加；
在IBA 處理下，隨著其濃度的增加，生根率先下降后上升，平均生根數(shù)呈增加趨勢；
在AC處理下，隨著其濃度的增加，生根率與平均生根數(shù)呈先上升后下降的趨勢。處理3、處理6、處理8 的生根率與平均生根數(shù)均為最高，生根率100%，平均生根數(shù)分別為13.90、13.77、13.73 條，且新生根系發(fā)達強健，數(shù)量多（圖5）。因此，品種N82 組培苗最優(yōu)生根誘導培養(yǎng)基為2.0 mg/L NAA+MS、2.0 mg/L IBA+MS、0.3 g/L AC+MS。
圖5 植物生長調(diào)節(jié)劑對品種N82 新生芽生根的影響
表5 植物生長調(diào)節(jié)劑對品種N82 和N136 不定芽生根的影響
品種N136 組培苗在3 種誘導條件下，同樣生根效果顯著。在NAA 處理下，隨著其濃度的增加，生根率與平均生根數(shù)呈先下降后上升的趨勢；
在IBA處理下，隨著其濃度的增加，組培苗生根率與平均生根數(shù)呈先下降后上升的趨勢；
在AC 處理下，隨著其濃度的增加，生根率與平均生根數(shù)呈上升趨勢。3 種誘導條件中，AC 對品種N136 生根效果最佳，處理9的生根率最高，為100%，平均生根數(shù)13.93 條，且新生根系質(zhì)量高并伴有次生根（圖6）；
NAA 與IBA 生根效果稍差，處理1 與處理6 的生根率分別為96.70%和90.00%。因此，品種N136 組培苗最優(yōu)生根培養(yǎng)基為0.5 g/L AC+MS。
圖6 植物生長調(diào)節(jié)劑對品種N136 新生芽生根的影響
2.5 不同基質(zhì)對組培苗移栽的影響
由表6 可知，品種N82 組培苗在處理3 條件下，移栽成活率最高，為100%，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），且移栽后生長良好，幼苗挺拔、葉片舒展新生數(shù)量多、顏色深綠油亮（圖7）。處理4 的成活率為93.30%，稍低于處理3；
處理1 的移栽成活率最低，為60.00%。因此，品種N82 組培苗最優(yōu)移栽基質(zhì)為草炭土∶河沙=1∶1。
圖7 移栽30 d 后品種N82 生長情況
表6 不同基質(zhì)對品種N82 和N136 組培苗移栽的影響
品種N136 組培苗在處理4 條件下，移栽成活率最高，為100%，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），且移栽后幼苗蔥郁挺拔，新生葉片較多，富有光澤，顏色濃綠（圖8）；
處理3 的成活率為83.30%，稍低于處理4；
處理1 與處理2 的移栽成活率均較低，分別為53.30 和56.70。因此，品種N136 組培苗最優(yōu)移栽基質(zhì)為草炭土∶珍珠巖∶河沙=1∶1∶1。
圖8 移栽30 d 后品種N136 生長情況
對外植體材料進行有效的消毒滅菌，防止外界微生物污染是組織培養(yǎng)的首要步驟。在相關(guān)消毒滅菌研究中，韓淞名等[10]得出外植體最優(yōu)消毒方式為75%乙醇消毒20 s，后用10%NaClO 處理8 min。樊敏等[11]研究認為，75%乙醇配合0.1%HgCl2處理外植體滅菌效果較好。本試驗兩種食用百合外植體材料從土壤中獲取，病菌含量較高，所以采用高濃度消毒劑并適當延長了消毒時間。受通風條件所限，本試驗選擇低毒性消毒劑進行滅菌。此外，在組織培養(yǎng)過程中外植體的選擇與選材部位會影響誘導方向和誘導率。在南川百合組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究中，趙靜等[12]采用鱗片、葉片、莖段、花器官和再生小鱗莖的鱗片等不同器官探究了南川百合最優(yōu)外植體部位，為鱗片下部。胡彬杰等[13]以沂水食用百合鱗莖為外植體，探討了其不同部位對誘導率的影響，得出最佳誘導位置為鱗莖的內(nèi)層中部。本試驗參考胡彬杰等[13]的研究結(jié)果，且由于食用百合鱗莖易于獲取，方便貯藏，富含營養(yǎng)物質(zhì)更利于不定芽誘導與后期生長，所以選取鱗莖鱗片作為外植體進行體外培養(yǎng)。
在不定芽誘導過程中，本試驗發(fā)現(xiàn)品種N82 外植體在2，4-D 與6-BA 共同誘導條件下，成功誘導出再生芽，且低濃度2，4-D（0.5 mg/L）和較高濃度6-BA（1.0 mg/L）組合誘導效果最優(yōu)。但2，4-D 與6-BA 組合對品種N136 不定芽誘導效果不佳，誘導率極低。試驗又以NAA 和6-BA 組合，重新對品種N136 外植體進行處理，發(fā)現(xiàn)不定芽誘導效果良好，且較高濃度的NAA（1.0 mg/L）與6-BA（1.0 mg/L）組合誘導率更高。張艷波[14]研究得出，在培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 2，4-D 與0.5 mg/L 6-BA 可誘導毛百合愈傷組織發(fā)生。而陳姝男[15]研究發(fā)現(xiàn)，在加入1.0 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L 6-BA 的基礎上，再添加少量AC，可使寶興百合產(chǎn)生不定芽且效果明顯。本試驗結(jié)果與張艷波[14]和陳姝男[15]研究結(jié)果存在差異，出現(xiàn)差異的原因可能是試驗所選取的百合品種、外植體部位和誘導方向不同所致，本試驗通過由外植體直接形成器官原基誘導形成不定芽的方式，獲得完整的再生植株。
在不定芽增殖試驗中，蘇菁華[16]利用0.2 mg/L TDZ 誘導渥丹與川百合的不定芽，誘導率高達86%。呂翠竹等[17]在綠花百合組培芽增殖研究中，添加0.2 mg/L TDZ 與0.2 mg/L NAA 來促進不定芽增殖，增殖系數(shù)為5.59。與本試驗所得結(jié)果相同，表明低濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ，對不定芽的增殖有明顯的促進作用。
在生根誘導過程中，本試驗選擇生長素（NAA、IBA）與AC 分別對不定芽進行生根誘導。而仙鶴等[18]在對蘭州百合組培苗進行生根誘導時探究糖源對生根的影響得出40 g/L 蔗糖+1/2MS 為最優(yōu)生根培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)一定濃度的蔗糖利于組培苗生根。邵果園等[18]則在黃色馬蹄蓮組培快繁研究中得到最優(yōu)生根培養(yǎng)基為0.4 mg/L IBA+1/2MS；
張艷波[13]在試驗中得出毛百合最優(yōu)生根培養(yǎng)基為0.5 g/L AC+MS。本試驗發(fā)現(xiàn)高濃度生長素對食用百合N82 組培苗生根更為有效，且生根迅速，新生根系發(fā)達；
AC 為品種N136 組培苗生根提供暗環(huán)境，促進根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用。
本試驗中2 個品種均表現(xiàn)出較高的移栽成活率，說明選取的3 種基質(zhì)及配比對幼苗移栽影響顯著。邵果園等[19]研究得出，腐質(zhì)土∶椰糠∶珍珠巖=1∶1∶1時，黃色馬蹄蓮的移栽成活率最高；
韓淞名等[10]研究得出，草炭土∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1 時，雄性不育百合的移栽效果最佳；
陳少鵬等[20]研究得出，毛百合的最優(yōu)移栽基質(zhì)為草炭土∶園土∶河沙=1∶1∶1 時，移栽狀態(tài)良好。本試驗所選移栽基質(zhì)成分與其他學者所選存在差異，其原因在于試驗材料的品種生長特性與原生環(huán)境不同所致。