張紅丹，徐誠(chéng)，王彤，張娟，宋寧慧
1.東南大學(xué) a.公共衛(wèi)生學(xué)院 b.環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009
2.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042
2009年，《斯德哥爾摩公約》將多溴二苯醚列為持久性有機(jī)污染物，有機(jī)磷酸酯（organophosphate esters，OPEs）替代多溴二苯醚，作為一類(lèi)新興阻燃劑被廣泛應(yīng)用［1］。OPEs 主要用作塑料、聚氨酯泡沫、紡織品、熱固性涂料和高分子混合物中的阻燃劑和添加劑［2］。OPEs 還應(yīng)用于電子設(shè)備［3］、嬰兒產(chǎn)品［4］和食品包裝［5］。2004—2015年，全球OPEs 的總消費(fèi)量由21 萬(wàn)t 增長(zhǎng)至68 萬(wàn)t，并逐年增長(zhǎng)［6-8］。OPEs 用作材料添加劑可能會(huì)因非化學(xué)鍵結(jié)合而輕易地通過(guò)揮發(fā)、產(chǎn)品磨損和泄漏釋放到環(huán)境中［2］。因此，大氣［9］、水［10］和土壤［11］中已經(jīng)廣泛檢測(cè)到OPEs。目前，住宅［12］、辦公空間［13］和育兒場(chǎng)所［14］等許多人居環(huán)境中也檢測(cè)到OPEs。
OPEs是合成磷酸衍生物，其結(jié)構(gòu)按照酯鍵的不同可大致分為三類(lèi)：氯化OPEs、烷基OPEs和芳基OPEs。OPEs 可通過(guò)I 相和II 相生物轉(zhuǎn)化代謝為更親水且更易消除的代謝物［15］。
OPEs 經(jīng)I 相代謝產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物為磷酸二酯［16］：氯化OPEs磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP）、磷酸三（2-氯丙基）酯（TCPP）和磷酸三（1，3-二氯異丙基）酯（TDCPP）經(jīng)I 相代謝產(chǎn)生雙（2-氯乙基）磷酸酯（BCEP）、雙（1-氯-2-丙基）磷酸酯（BCPP）和雙（1，3-二氯-2-丙基）磷酸酯（BDCPP）；
烷基OPEs 磷酸三乙酯（TEP）、磷酸三正丁酯（TnBP）和磷酸三（2-丁氧基乙基）酯（TBEP）經(jīng)I相代謝產(chǎn)生磷酸二乙酯（DEP）、磷酸二正丁酯（DnBP）和雙（丁氧乙基）磷酸酯（BBEP）；
芳基OPEs 磷酸三苯酯（TPhP）經(jīng)I 相代謝產(chǎn)生磷酸二苯酯（DPhP）。尿液中量化的磷酸二酯已被確定為評(píng)估人類(lèi)OPEs 暴露的生物標(biāo)志物［17-18］。
以往的研究發(fā)現(xiàn)，暴露于OPEs 可引起神經(jīng)毒性［19］、生殖毒性［20］和內(nèi)分泌紊亂［21］等。動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，暴露于OPEs 能夠引起氧化應(yīng)激［22-23］。氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體和核DNA 的損傷，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用［24］。8-羥基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）是DNA 受損修復(fù)后釋放的核苷，被廣泛用作DNA 損傷和氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物［25-28］。流行病學(xué)研究表明，OPEs 暴露與氧化應(yīng)激之間存在關(guān)聯(lián)［29-31］。
本研究通過(guò)檢測(cè)304 名體檢人群尿液中7 種OPEs代謝產(chǎn)物與8-OHdG 的水平，分析尿液OPEs 代謝產(chǎn)物與8-OHdG 之間的關(guān)聯(lián)，探討成年人暴露于OPEs 是否在代謝過(guò)程中引起氧化應(yīng)激。
1.1 研究對(duì)象
研究對(duì)象為2017年于南京兩醫(yī)院參加健康體檢的普通成人304名，平均年齡為（35±10）歲（18～65歲），女性135 名和男性169 名。研究對(duì)象各體檢指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，無(wú)吸煙、飲酒史。基本個(gè)人信息來(lái)自健康體檢問(wèn)卷。按照健康體檢的要求，使用50 mL聚丙烯試管收集晨尿，標(biāo)記后放置冰盒內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在-80℃保存待用。本研究倫理許可已由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2015ZDKYSB038），研究對(duì)象均知情同意。
1.2 化學(xué)品和試劑
DEP（97.6%純度）、DnBP（99.9%純度）、DPhP（96%純度）、BCEP（95%純度）、BCPP（95%純度）、BBEP（96%純度）和BDCPP（95%純度）7 種OPEs 代謝產(chǎn)物和8-OHdG（97%純度）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于加拿大Toronto Research Chemicals。乙腈購(gòu)于德國(guó)Merck（色譜純，＞99%純度）。
1.3 樣品制備和儀器分析
尿液的預(yù)處理程序如下：將10 mL 尿液樣品放入50 mL離心管中，然后加入鹽酸將尿液pH值酸化至5；
尿液樣品在80℃的水浴中水解2 h，恢復(fù)到室溫后加入10 mL 乙腈溶液和3 g 氯化鈉，渦旋1 min；
6 910×g離心5 min；
取5 mL 上層溶液通過(guò)自制濾筒（該濾筒中裝有100 mg N-丙基乙二胺、20 mg 石墨化炭黑、4 g無(wú)水硫酸鈉），收集在容量試管中；
上樣后，取5 mL上層溶液進(jìn)行洗脫，收集的洗脫液在恒溫氮吹儀（中國(guó)天津奧特賽斯）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至接近干燥；
加入1 mL 乙腈使體積恒定，將溶液通過(guò)0.22 μm 濾膜過(guò)濾。將制備好的樣品儲(chǔ)存在-20℃等待儀器分析。
使用高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿離子阱質(zhì)譜儀（LC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國(guó)Agilent）測(cè)量尿液樣品中OPEs 代謝物和8-OHdG 的質(zhì)量濃度（后稱(chēng)濃度）。在ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm；
美國(guó)Agilent）上分離所有分析物（目標(biāo)物質(zhì)總離子流見(jiàn)補(bǔ)充材料圖S1）。含有0.2%氨水溶液和乙腈用作流動(dòng)相。梯度洗脫程序設(shè)置如下：0～2 min，1%乙腈；
2～4 min，1%～20%乙腈；
4～6 min，含20%～40%乙腈；
6～8 min，40%～60%乙腈；
8～9 min，60%～40%乙腈；
9～9.1 min，40%～1%乙腈；
9.1～10 min，1%乙腈。每個(gè)樣品注入5 μL 提取液，流速設(shè)置為0.3 mL·min-1，柱溫保持在30℃。電噴霧電離以負(fù)離子模式進(jìn)行。電離電壓為-5 500 V，離子源溫度為500℃。補(bǔ)充材料表S1中列出其他的優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，包括每種目標(biāo)化合物的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量、入口電壓和出口電壓。尿肌酐水平的測(cè)定按照肌酐測(cè)定試劑盒（L-Type Creatinine M，日本FUJIFILM）的說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。
1.4 質(zhì)量控制
用于計(jì)算尿液樣品中目標(biāo)化合物濃度的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍為0.01～200 μg·L-1，校準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)＞0.997。檢測(cè)限（信噪比≥3）范圍為0.03～18.33 ng·L-1，定量限（信噪比≥10）為0.10～55.00 ng·L-1。本底值低于檢測(cè)限。方法回收率的測(cè)量是檢測(cè)3 種不同濃度（10、100、200 ng·L-1）的加標(biāo)樣品（基質(zhì)為人工尿），并為每種濃度設(shè)置5 個(gè)平行樣品，3 種濃度的加標(biāo)樣品的回收率達(dá)到52.36%～114.56%，精密度低于10%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)補(bǔ)充材料表S2。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
使用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。針對(duì)個(gè)體肌酐水平調(diào)整OPEs代謝產(chǎn)物和8-OHdG的尿液濃度，單位以μg·g-1表示。7種OPEs代謝物的總濃度表示為Σ7OPEMs。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用幾何均數(shù)（geometric mean，GM）表示。采用Mann–WhitneyU檢驗(yàn)研究?jī)山M之間的差異。Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)和多元線性回歸分析用于檢驗(yàn)不同變量之間的相關(guān)性；
在進(jìn)行Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)和多元線性回歸分析之前，將OPEs 代謝產(chǎn)物和8-OHdG的濃度進(jìn)行常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。使用GraphPad Prism 8.0制作圖形。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.1 尿液OPEs 代謝產(chǎn)物濃度
表1顯示體檢人群尿液樣本中OPEs 代謝產(chǎn)物的濃度。尿液中7 種OPEs 代謝產(chǎn)物檢出率范圍為53.6%～99.3%。尿液中Σ7OPEMs GM濃度為15.01 μg·g-1。BCPP（GM：4.88 μg·g-1）和DnBP（GM：4.61 μg·g-1）是成年人尿液最豐富的OPEs 代謝產(chǎn)物，其次是DPhP（GM：1.00 μg·g-1）、BCEP（GM：0.73 μg·g-1）、BDCPP（GM：0.72 μg·g-1）、DEP（GM：0.59 μg·g-1）和BBEP（GM：0.57 μg·g-1）。
表1 南京兩醫(yī)院體檢人群尿液中OPEs 代謝產(chǎn)物和8-OHdG的分布（n=304）Table 1 Distributions of urinary OPEs metabolites and 8-OHdG among selected physical examination population in two Nanjing hospitals (n=304)
2.2 性別相關(guān)的尿液OPEs 代謝物水平
表2顯示體檢人群尿液樣本中OPEs 代謝產(chǎn)物的性別差異。尿液DEP、DnBP、BCPP、BBEP 和BDCPP在男性和女性之間存在差異（P＜0.05）：對(duì)于尿液DnBP、BCPP和BDCPP，男性高于女性（GM：5.83、6.44、0.86μg·g-1vs 5.47、3.42、0.69μg·g-1）；
但是，對(duì)于尿液DEP 和BBEP，女性遠(yuǎn)高于男性（GM：7.44、5.25μg·g-1vs 0.67、0.80μg·g-1）。
表2 南京兩醫(yī)院體檢人群尿液中OPEs 代謝產(chǎn)物的性別差異Table 2 Gender differences in urinary OPEs metabolites among selected physical examination population in two Nanjing hospitals單位（Unit）：μg·g-1
2.3 OPEs暴露與氧化應(yīng)激之間的關(guān)聯(lián)
經(jīng)過(guò)肌酐調(diào)整后，通過(guò)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析單個(gè)OPEs代謝產(chǎn)物與8-OHdG尿液濃度（常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）之間的相關(guān)性（圖1）。結(jié)果表明：8-OHdG與DEP（r=0.219）、DnBP（r=0.417）、DPhP（r=0.308）、BCEP（r=0.420）、BDCPP（r=0.287）和Σ7OPEMs（r=0.276）均呈正相關(guān)（均P＜0.01）；
但是，尿液中8-OHdG與BCPP、BBEP相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)補(bǔ)充材料圖S2）。
圖1 南京兩醫(yī)院體檢人群尿液中OPEs代謝產(chǎn)物與8-OHdG濃度的Pearson相關(guān)性Figure 1 Pearson correlations between urinary OPEs metabolites and 8-OHdG concentrations among selected physical examination population in two Nanjing hospitals
經(jīng)過(guò)肌酐調(diào)整后，按照性別分層，通過(guò)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析不同性別下單個(gè)OPEs 代謝產(chǎn)物與8-OHdG 尿液濃度（常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：男性尿液8-OHdG 與DEP（r=0.240）、DnBP（r=0.436）、DPhP（r=0.367）、BCEP（r=0.448）、BDCPP（r=0.348）和Σ7OPEMs（r=0.327）均呈正相關(guān)（均P＜0.05，見(jiàn)補(bǔ)充材料圖S3）；
女性尿液8-OHdG 與BBEP 呈正相關(guān)（r=0.233，P＜0.05，見(jiàn)補(bǔ)充材料圖S4）。
經(jīng)過(guò)肌酐調(diào)整后，控制性別和年齡混雜因素，通過(guò)多元線性回歸分析來(lái)進(jìn)一步探討單個(gè)OPEs代謝產(chǎn)物與8-OHdG 尿液濃度（常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）之間的關(guān)聯(lián)（表3）。結(jié)果表明，8-OHdG 與DEP（b=0.182）、DnBP（b=0.418）、DPhP（b=0.303）、BCEP（b=0.418）、BDCPP（b=0.284）和Σ7OPEMs（b=0.281）存在正向關(guān)聯(lián)（均P＜0.05）。
表3 南京兩醫(yī)院體檢人群尿液中OPEs 代謝產(chǎn)物與8-OHdG 濃度的多元線性回歸分析Table 3 Multiple linear regression analysis on urinary OPEs metabolites and 8-OHdG concentrations among selected physical examination population in two Nanjing hospitals
本研究調(diào)查于南京兩醫(yī)院參加健康體檢的普通成人尿液中OPEs 代謝產(chǎn)物與氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物8-OHdG 之間的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)：DnBP 和BCPP 是普通成人尿液中最豐富的OPEs 代謝產(chǎn)物；
DEP、DnBP 、BCPP、BBEP 和BDCPP 有性別差異，男性DnBP、BCPP和BDCPP 高于女性，女性DEP 和BBEP 高于男性；
Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)分析顯示8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP 和BDCPP 呈正相關(guān)；
性別分層后，男性8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP 和BDCPP 呈正相關(guān)，女性8-OHdG 與BBEP 呈正相關(guān)；
進(jìn)一步校正性別和年齡后，多元線性回歸分析顯示8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP和BDCPP有正向關(guān)聯(lián)。
將本研究與不同研究報(bào)告的成年人（≥18 歲）尿液OPEs 代謝物濃度進(jìn)行比較（見(jiàn)補(bǔ)充材料表S3），DPhP 和BDCPP 是先前研究分析的兩種最常見(jiàn)的OPEs代謝物，本研究的DPhP（GM：0.67 μg·L-1）尿液水平遠(yuǎn)低于美國(guó)（0.71～1.137 μg·L-1）和加拿大（1.7 μg·L-1）；
BDCPP（0.48 μg·L-1）尿液水平與加拿大（0.55 μg·L-1）相似，但遠(yuǎn)低于美國(guó)（0.69～2.321 μg·L-1）。對(duì)于尿液DEP和BCEP，本研究數(shù)據(jù)（DEP：0.44 μg·L-1；
BCEP：0.49 μg·L-1）與美國(guó)（DEP：0.348 μg·L-1；
BCEP：0.354～0.38 μg·L-1）相當(dāng)。本研究觀察到成年人尿液中DnBP（3.11 μg·L-1）、BCPP（3.36 μg·L-1）和BBEP（0.46 μg·L-1）水平遠(yuǎn)高于美國(guó)（DnBP：0.0168～0.18 μg·L-1；
BCPP：0.0838 、0.18 μg·L-1；
BBEP：0.0326 μg·L-1）和加拿大（DnBP：0.08 μg·L-1）。
先前的研究表明，在OPEs 代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)性別相關(guān)差異［32-35］。例如，成年男性血清中磷酸三異丁酯的濃度高于女性［34］，女孩TPhP 的暴露風(fēng)險(xiǎn)高于男孩［32］，女性頭發(fā)中TPhP 的濃度明顯高于男性［33］。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上［36］，經(jīng)過(guò)肌酐校正，并增加了樣本量，結(jié)果顯示尿液DEP、DnBP 、BCPP、BBEP 和BDCPP 在男性和女性之間有差異（表2）。原因可能是男性和女性之間的OPEs 暴露來(lái)源和水平不同，這將影響尿液中OPEs 代謝產(chǎn)物的水平。例如，部分女性產(chǎn)品（例如指甲油）是OPEs 的重要來(lái)源，可增加女性暴露于OPEs的風(fēng)險(xiǎn)［37］。
本研究結(jié)果顯示，Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析后，尿液8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP 和BDCPP 呈正相關(guān)（圖1）。進(jìn)一步校正性別和年齡后，多元線性回歸分析顯示尿液8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP和BDCPP 有關(guān)聯(lián)（表3）。先前的研究也發(fā)現(xiàn)OPEs 代謝產(chǎn)物與氧化應(yīng)激之間的關(guān)聯(lián)：波多黎各孕婦尿液中BCEP、BCPP 和DPhP 與8-OHdG 的增加有關(guān)［29］；
日本7歲兒童尿液中BBEP、DPhP 和8-OHdG 之間存在正相關(guān)性［30］；
生活在電子垃圾區(qū)域的人群尿液中BCPP、BCEP、DPhP和DnBP與8-OHdG水平呈正相關(guān)［31］。動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，TCEP 和TPhP 會(huì)引起小鼠肝臟和睪丸TM3 Leydig 細(xì)胞的氧化應(yīng)激［22］。TDCPP 誘導(dǎo)腎上腺PC12 細(xì)胞的氧化應(yīng)激，盡管未觀察到細(xì)胞活力降低［23］。關(guān)于OPEs 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的機(jī)制，以及OPEs 暴露對(duì)氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的影響仍需要進(jìn)行更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究。
本研究有一定的局限性：第一，本研究屬于橫斷面研究設(shè)計(jì)，不能從本數(shù)據(jù)中建立因果關(guān)系；
第二，8 種檢測(cè)物質(zhì)中，DEP 的加標(biāo)回收率低于70%；
第三，機(jī)體可能受多種污染物（苯、重金屬和空氣污染物等）復(fù)合暴露的影響，但本研究只調(diào)查了OPEs 代謝產(chǎn)物與8-OHdG 的關(guān)聯(lián)；
第四，研究中也未調(diào)查其他的氧化應(yīng)激風(fēng)險(xiǎn)因素，如生活方式、經(jīng)濟(jì)和教育狀況等，可能會(huì)使結(jié)論產(chǎn)生偏倚。因此進(jìn)一步的研究需要控制更多的混雜因素。
綜 上，本研究發(fā)現(xiàn)DEP、DnBP、DPhP、BCEP 和BDCPP與氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物8-OHdG 水平升高相關(guān)，表明成年人暴露于OPEs 可能會(huì)在代謝過(guò)程中引起氧化應(yīng)激。本研究為進(jìn)一步探索環(huán)境化學(xué)污染物暴露對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激風(fēng)險(xiǎn)的影響提供了流行病學(xué)證據(jù)。未來(lái)應(yīng)開(kāi)展研究以查明OPEs 干擾氧化應(yīng)激潛在的生物學(xué)機(jī)制和其介導(dǎo)的健康效應(yīng)。
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