岳博文，倪露，鄭瑩，胡凡馨，楊啟巧，袁成福，袁丁，王金娥，周志勇（國家中醫藥管理局中藥藥理三級實驗室，三峽大學醫學院，湖北 宜昌 443002）
衰老是神經退行性疾病如阿爾茨海默病（AD）、帕金森病（PD）及亨廷頓病（HD）等發生發展的最大風險因素[1]，幾乎所有老化的大腦都表現出與神經退行性疾病相關的特征性變化。衰老與認知功能障礙密切相關，研究發現衰老大鼠的海馬CA1 區突觸后密度減小、海馬CA3 區突觸素降低，空間學習能力明顯下降[2]；
衰老恒河猴在長時間的記憶間隔實驗中表現出學習缺陷和顯著的記憶障礙[3]。研究[4]表明，成纖維細胞生長因子21（FGF21）在中樞神經系統損傷修復中具有重要作用，給予外源性FGF21 可以緩解APP/PS1 轉基因AD 小鼠的記憶功能障礙，FGF21 還可以通過PP2A/MAPKs/HIF-1α 通路保護AD 樣病變處的神經元。竹節參總皂苷是中藥竹節參的主要活性成分，具有抗炎、延緩衰老等多種藥理作用[5]。本課題組前期研究[6]發現，竹節參總皂苷對衰老大鼠的神經炎癥具有較好的改善作用。因此，本研究擬繼續探討竹節參總皂苷對自然衰老大鼠認知功能障礙的改善作用，并從FGF21 抵抗角度探討其作用機制。
1.1 動物 50 只SPF 級雄性SD 大鼠，購自湖北省宜昌市三峽大學實驗動物中心，包括10 只5 月齡大鼠［體質量（510.67±37.24）g］及40 只18 月齡大鼠［體質量（756.83±35.72）g］，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。本實驗獲得三峽大學實驗動物倫理委員會批準，動物倫理審批號：2017030。
1.2 藥物及試劑 竹節參總皂苷（提取率為18.4%，純度為83.5%），由本課題組制備[7]。亞精胺，美國Sigma 公司，批號：BCBW6017；
β-actin 兔多克隆抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB11001；
FGF21 兔抗體（批號：A3908）、β-klotho兔抗體（批號：A15629），均購自武漢愛博泰克生物科技公司；
FGFR1 兔抗體，美國Cell Signaling 公司，批號：#9740；
P-ERK 小鼠單克隆抗體（批號：sc-7383）、ERK 小鼠單克隆抗體（批號：sc-94），均購自美國Santa Cruz 公司；
RIPA 裂解液（批號：2022R0FC1053）、BCA 蛋白濃度定量試劑盒（批號：P1511），均購自北京普利萊基因技術有限公司。
1.3 主要儀器 XR-XM101 型Morris 水迷宮，上海欣軟信息科技有限公司；
TYPE1500-458 型全波長酶標儀，美國Thermo Electron 公司；
H-7500 型透射電子顯微鏡，日本HITACHI 公司；
PowerPas Basic 200型電泳儀，美國Bio-Rad 公司；
Bioshin ChemiQ 4800 型化學發光成像顯影儀，上海歐翔科學儀器有限公司；
TP1020 型自動脫水機、EG1150C 型超薄切片機，德國Leica 公司。
1.4 分組、給藥及樣本采集、處理 將40 只18 月齡SD 雄性大鼠隨機分為模型組（10 只）、竹節參總皂苷低劑量組（10 mg·kg-1，10 只）、竹節參總皂苷高劑量組（30 mg·kg-1，10 只）、亞精胺組（1 mmol·L-1，10 只），另取10 只5 月齡雄性SD 大鼠作為對照組。模型組及對照組大鼠給予正常維持飼料；
竹節參總皂苷低、高劑量組大鼠分別給予含有藥物的混合飼料（按18 月齡大鼠每只每日進食量為5 g 計算，最終給藥劑量為10、30 mg·kg-1）；
亞精胺組大鼠給予正常維持飼料，同時自由飲用含亞精胺的飲用水（濃度為1 mmol·L-1）；
以上各組大鼠連續飼養4 個月。
給藥結束后，大鼠禁食不禁水12 h，按照5 mL·kg-1的劑量腹腔注射20%烏拉坦溶液對大鼠進行麻醉；
麻醉后腹主動脈取血，然后進行心臟灌流：打開胸腔暴露心臟，從左心室進針至主動脈，用動脈夾固定，剪開右心耳，生理鹽水沖洗20 min，待肝臟變白后，換成4%多聚甲醛溶液繼續灌注30 min。灌注結束后，快速斷頭取腦，部分大鼠分離出腦皮層及海馬組織，液氮中快速冷凍，樣本保存于-80 ℃冰箱備用；
部分大鼠將整個腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中備用。
1.5 Morris 水迷宮實驗 實驗前1 d 將水注入直徑為100 cm、高度為45 cm 的水池中，于某一象限中間位置放入平臺，使水面高于平臺2 cm，并畫出平臺位置；
提前將水溫加熱至15～25 ℃，并在實驗過程中保持水溫；
實驗開始前2 h 將大鼠移至操作間，使之適應實驗環境。前5 d 為適應性訓練，記錄大鼠找到平臺的潛伏期。第6 天撤走平臺，選擇平臺所在象限的對角象限邊緣中間位置為入水點，捕捉大鼠在60 s 內的行為軌跡。
1.6 HE 染色法檢測皮層及海馬神經元的病理變化灌注后將大鼠整個腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后進行梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片；
HE 染色后脫水，用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察皮層及海馬部位神經元的病理變化。
1.7 Nissl 染色法檢測皮層及海馬神經元尼氏體的變化 灌注后的大鼠腦組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h 后，用75%乙醇再浸泡24 h；
然后經過脫水、浸蠟后包埋、切片、攤片、烤片等步驟即得實驗用切片，切片厚度為4 μm。大鼠腦組織切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，擦干載玻片上多余的水，滴加Nissl 染液，37 ℃下浸染10 min；
雙蒸水沖洗，95%乙醇分化10 s，擦干多余的乙醇；
二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察大鼠皮層及海馬部位神經元數量的變化。
1.8 透射電鏡檢測皮層線粒體超微結構的變化 取灌注后的大鼠腦組織皮層部位0.5～1 mm3的小塊，組織塊先用2.5%戊二醛溶液在4 ℃下固定過夜；
隨后用PBS 漂洗，然后加入1%鋨酸在4 ℃下固定1 h；
經梯度乙醇-丙酮脫水，環氧樹脂包埋，制作半薄和超薄切片；
醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，采用透射電子顯微鏡觀察大鼠皮層線粒體超微結構。
1.9 Western Blot 法檢測皮層及海馬組織FGF21-FGFR1/β-Klotho 信號通路相關蛋白的表達 將大鼠皮層、海馬組織分別按照RIPA 裂解液∶PMSF∶磷酸化蛋白酶抑制劑A 液∶磷酸化蛋白酶抑制劑B液= 100∶1∶1∶1 的比例提取總蛋白，并用BCA 蛋白定量試劑盒檢測所提取蛋白的濃度。蛋白上樣量30 μg，進行電泳、轉膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h；
然后加入一抗后，4 ℃下孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次6 min；
加入二抗后常溫下孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min；
用ECL 顯影液進行顯影后掃描，以β-actin 為內參，采用ImageJ 軟件計算目的蛋白與內參蛋白的灰度比值，作為目的蛋白的相對表達水平。每組實驗至少重復3 次。
1.10 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 7.0 統計軟件進行數據分析；
計量資料以均數± 標準差（±s）表示；
多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；
以P＜0.05 為差異有統計學意義。
2.1 竹節參總皂苷對自然衰老大鼠空間學習記憶的影響 結果見圖1。與對照組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01），目標平臺穿越次數、目標象限停留時間均顯著減少（P＜0.01），首次到達目標平臺路程顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，竹節參總皂苷高劑量組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），目標平臺穿越次數、目標象限停留時間均顯著增加（P＜0.01），首次到達目標平臺路程顯著減少（P＜0.01）。結果表明，竹節參總皂苷可以有效減輕自然衰老模型大鼠的行為學障礙癥狀，改善空間學習記憶能力。
圖1 竹節參總皂苷（SPJ）對自然衰老大鼠認知功能障礙的影響（±s，n=5～9）Figure 1 Effect of saponins of Panax Japonicus on cognitive dysfunction in natural aging rats（±s，n=5-9）
2.2 竹節參總皂苷對自然衰老大鼠皮層及海馬神經元病理變化的影響 結果見圖2。對照組大鼠的皮層及海馬神經元排列整齊、大小形態及核形態正常、有少量異染色質、核仁邊界清晰，多位于胞體中心。與對照組比較，模型組大鼠出現大量細胞核腫脹和固縮神經元，分布在整個皮層及海馬區域，細胞核模糊甚至空泡化，小膠質細胞顯著增多。與模型組比較，竹節參總皂苷低、高劑量組大鼠神經元損傷有所改善，神經元排列恢復整齊，核異質性和細胞腫脹減輕。
圖2 竹節參總皂苷（SPJ）對自然衰老大鼠皮層及海馬神經元病理變化的影響（HE 染色，×200）Figure 2 Effects of saponins of Panax Japonicus on pathological changes of cortex and hippocampus neurons in natural aging rats（HE staining，×200）
2.3 竹節參總皂苷對自然衰老大鼠皮層及海馬神經元尼氏體變化的影響 結果見圖3。尼氏體可作為神經元功能狀態的標志，當神經元受損時，尼氏體減少，通過尼氏體染色數目及著色深淺可以判斷神經元損傷情況。對照組大鼠皮層及海馬組織神經元細胞質中尼氏體含量較多，染色深；
與對照組比較，模型組大鼠皮層及海馬組織神經元中尼氏體著色變淺，數量減少，表明神經元受損；
與模型組比較，竹節參總皂苷低、高劑量組大鼠皮層及海馬區尼氏體數量增加，染色加深，神經元損傷得到改善。
圖3 竹節參總皂苷（SPJ）對自然衰老大鼠皮層及海馬神經元尼氏體變化的影響（Nissl 染色，×200）Figure 3 Effects of saponins of Panax Japonicus on changes of Nissl body in cortex and hippocampus neurons in natural aging rats（Nissl staining，×200）
2.4 SPJ 對自然衰老大鼠神經元線粒體超微結構的影響 結果見圖4。與對照組比較，模型組大鼠的神經元線粒體嚴重受損，表現為腫脹、嵴斷裂或消失和線粒體空泡化；
與模型組比較，竹節參總皂苷低、高劑量組大鼠的神經元線粒體膜完整，嵴排列規則，沒有明顯的腫脹、損傷和線粒體空泡化。
圖4 竹節參總皂苷（SPJ）對自然衰老大鼠皮層中線粒體超微結構的影響（透射電鏡，×20 000）Figure 4 Effect of saponins of Panax Japonicus on the ultrastructure of cortex mitochondria in natural aging rat（TEM，×20 000）
2.5 竹節參總皂苷對自然衰老大鼠皮層及海馬組織中FGF21-FGFR1/β-klotho 信號通路相關蛋白表達水平的影響 結果見圖5、圖6。與對照組比較，模型組大鼠皮層及海馬組織中FGF21 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），FGFR1、β-klotho、P-ERK 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，竹節參總皂苷低、高劑量組大鼠皮層及海馬組織中FGF21 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），P-ERK、FGFR1、β-klotho 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，竹節參總皂苷可能通過FGF21-FGFR1/β-klotho 信號通路減輕FGF21 抵抗，改善自然衰老大鼠的認知功能障礙。
圖5 竹節參總皂苷（SPJ）對自然衰老大鼠皮層組織中FGF21-FGFR1/β-klotho 信號通路相關蛋白表達的影響（±s，n=4～5）Figure 5 Effect of saponins of Panax Japonicus on FGF21-FGFR1/β-klotho signaling pathway related protein expression of cortex in natural aging rats（±s，n=4-5）
圖6 竹節參總皂苷（SPJ）對自然衰老大鼠海馬組織中FGF21-FGFR1/β-klotho 信號通路相關蛋白表達的影響（±s，n=4～5）Figure 6 Effect of saponins of Panax Japonicus on FGF21- FGFR1/β- klotho signaling pathway related protein expression of hippocamppus in natural aging rats（±s，n=4-5）
衰老是自然發生的生物過程，伴隨身體功能和認知能力下降。認知功能下降是導致老年人生活質量降低的重要因素。本研究通過Morris 水迷宮實驗表明，衰老大鼠的逃避潛伏期顯著延長，目標平臺穿越次數、目標象限停留時間均顯著減少，首次到達目標平臺路程顯著增加，提示其學習記憶能力受損，認知功能出現障礙。
FGF21 是成纖維細胞生長因子家族的一員，在維持機體葡萄糖和脂質代謝穩態中發揮關鍵作用[8-9]。同時，FGF21 也是衰老相關疾病潛在的生物標志物[10]。研究[11]發現，FGF21 可以增加海馬突觸可塑性和預防認知能力下降，發揮神經保護作用。外源性給予FGF21 可以減輕D-gal 處理小鼠的海馬神經元損傷，降低MDA 和ROS 水平，提高大腦學習記憶能力[12]。FGF21 還可以有效改善Aβ 模型中神經元異常凋亡和tau 過度磷酸化，進而改善AD 大鼠認知功能障礙[13]。研究[14-15]顯示，血清FGF21 水平隨著衰老而升高，附睪脂肪組織中FGF21 的受體——成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）和輔助受體β-klotho（一種跨膜糖蛋白）蛋白表達水平隨著年齡增長而明顯下降，且FGF21 下游的磷酸化細胞外信號調節蛋白激酶（P-ERK）通路激活受到抑制，提示衰老過程中機體會出現FGF21 抵抗。還有研究[16]發現，糖尿病小鼠胰島中的β-klotho 表達呈年齡依賴性下調，給予羅格列酮治療可以激活PPARγ 信號，進而阻止β-klotho 表達水平下調，并減輕FGF21 抵抗。本研究結果表明，自然衰老大鼠皮層和海馬組織中FGF21 蛋白表達水平明顯升高，而FGFR1、β-klotho及P-ERK 蛋白表達水平明顯降低，提示衰老大鼠出現FGF21 抵抗；
給予竹節參總皂苷干預后，皮層和海馬組織中FGF21 蛋白水平明顯降低，FGFR1、β-klotho 及P-ERK 蛋白表達水平明顯升高，FGF21 抵抗得到明顯改善。
研究[17]表明，衰老與線粒體結構和功能的變化密切相關，線粒體膜結構隨著年齡增長發生依賴性變化，例如嵴和內膜囊泡的消失。同時，編碼線粒體蛋白的基因轉錄水平隨著年齡增長而下降，并伴隨著神經退化和認知功能障礙[18]。研究[19]發現，銀杏葉提取物（EGb 761）在AD 動物模型中通過改善線粒體功能障礙，可以逆轉與年齡相關的認知功能障礙。給予FGF21 也可以減輕腦線粒體功能障礙和腦細胞凋亡，防止肥胖大鼠的認知能力下降[11]。衰老伴隨著神經元損傷，給予白杉醇可防止D-gal 誘導的小鼠神經元丟失，增加尼氏體的數量，并增強空間學習和記憶能力[20]。本研究通過尼氏染色顯示，衰老大鼠的皮層和海馬神經元尼氏體顏色變淺，神經元數量明顯減少；
電鏡結果顯示，衰老大鼠的神經元線粒體腫脹、嵴斷裂或消失；
衰老模型大鼠出現認知功能障礙，并伴隨神經元線粒體明顯損傷。給予竹節參總皂苷干預后，衰老大鼠的神經元損傷得到明顯改善，尼氏體數量明顯增加，神經元線粒體膜完整，嵴排列規則，線粒體結構損傷明顯減輕，空間學習記憶能力得到明顯改善。
綜上所述，竹節參總皂苷能有效改善自然衰老大鼠的認知功能障礙，同時改善其皮層及海馬組織病理變化，提高神經元尼氏體數量，主要作用機制可能與通過FGF21-FGFR1/β-klotho 信號通路減輕FGF21 抵抗，并改善神經元線粒體結構損傷有關。
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