蘇桂軍 李霞 陳芋西 詹潔 王愛(ài)勤 何龍飛 肖冬
摘 要：? 花粉類受體蛋白激酶（pollen receptor-like protein kinase，PRK）是一類富含LRR結(jié)構(gòu)域的類受體蛋白激酶，不僅在花粉發(fā)育和植物受精中發(fā)揮作用，也在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。基于對(duì)前期花生根尖鋁脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，我們發(fā)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)鋁脅迫的花粉類受體蛋白激酶基因AhPRK4，為探究AhPRK4在花生鋁脅迫中的功能，該文進(jìn)一步分析了鋁脅迫處理下AhPRK4在花生耐鋁品種‘99-1507和鋁敏感品種‘中花2號(hào)（‘ZH2）根尖中的轉(zhuǎn)錄變化，通過(guò)序列分析、進(jìn)化樹構(gòu)建等分析了AhPRK4蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和親緣關(guān)系，克隆了AhPRK4的胞內(nèi)域序列（AhPRK4-CD），并通過(guò)原核表達(dá)和體外磷酸化體系分析了AhPRK4-CD的自磷酸化活性。結(jié)果表明：（1）不同鋁處理時(shí)間及不同鋁濃度處理后，AhPRK4的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，顯著響應(yīng)鋁處理，是鋁誘導(dǎo)基因；
（2）AhPRK4含有673個(gè)氨基酸，屬于LRR-III蛋白激酶家族成員，具跨膜域和信號(hào)肽，且預(yù)測(cè)具有磷酸化活性位點(diǎn)；
（3）體外誘導(dǎo)表達(dá)出約71 kD的可溶性蛋白（GST-AhPRK4-CD），經(jīng)凝膠親和層析純化，得到基于蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）驗(yàn)證正確的重組蛋白，重組蛋白可發(fā)生磷酸化修飾，但無(wú)明顯的自磷酸化現(xiàn)象。綜上認(rèn)為，AhPRK4是一個(gè)鋁脅迫應(yīng)答基因，參與花生鋁脅迫早期應(yīng)答機(jī)制，且能發(fā)生磷酸化修飾。
關(guān)鍵詞：
花生， 鋁脅迫， 花粉類受體蛋白激酶， 表達(dá)分析， 原核表達(dá)
中圖分類號(hào)：? Q943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）06-1070-10
Prokaryotic expression analysis of aluminum associated receptor-like protein kinase AhPRK4 in peanut （Arachis hypogaea）
SU Guijun1， LI Xia1， CHEN Yuxi1， ZHAN Jie1，2，3， WANG Aiqin1，2，3， HE Longfei1，2，3， XIAO Dong1，2，3*
（1. National Demonstration Center for Experimental Plant Science Education/College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China;
2. Guangxi Key Laboratory for Agro-Environment and Agro-Product Safety， Nanning 530004， China; 3. Key Laboratory of
Crop Cultivation and Tillage， Guangxi Colleges and Universities， Nanning 530004， China ）
Abstract：? The pollen receptor-like protein kinase （PRK） family， an LRR receptor-like protein kinase， not only plays a role in pollen development and fertilization， but also plays a role in stress response. Based on the analysis of transcriptome data that generated in our previous study， we found that AhPRK4 was an aluminum-responsive gene. To explore the role of AhPRK4 in response to aluminum stress， we analyzed the expression of AhPRK4 by qRT-PCR in ‘ZH2 （Al-sensitive） and ‘99-1507 （Al-tolerant）， clarified the protein structure and genetic relationship of AhPRK4 by sequence analysis， phylogenetic tree construction and other genetic analysis， constructed the recombinant plasmid by homologous recombination， obtained the intracellular domain recombinant protein of AhPRK4 by prokaryotic expression technology and determined the activity of the recombinant protein by incubation with phosphorylated antibodys. The results were as follows：
（1） The transcription level of AhPRK4 was up-regulated after different aluminum treatments time and different aluminum concentrations， indicating that AhPRK4 was an aluminum inducible gene. （2） The AhPRK4 protein had 673 amino acids with transmembrane domain， signal peptide and phosphorylation active sites， belonging to the LRR-III protein kinase family. （3） The GST-AhPRK4-CD recombinant protein was induced in vitro and verified by Western Blot. And the recombinant protein had phosphorylated on both serine/threonine and tyrosine residues， but had no significant auto-phosphorylation activity. In conclusion， AhPRK4 is an aluminum responsive gene， which participates in the regulation of short-term aluminum stress and is phosphorylated in vitro.
Key words：
peanut （Arachis hypogaea）， aluminum stress， pollen receptor-like protein kinase， expression analysis， prokaryotic expression
花生（Arachis hypogaea）是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，是主要的食用植物油來(lái)源。在我國(guó)，花生產(chǎn)區(qū)可分為南方產(chǎn)區(qū)和北方產(chǎn)區(qū)。但是南方地區(qū)的土壤多為酸性土壤，pH值在4.5～6.0之間，Al2O3含量高，交換性Al3+占陽(yáng)離子交換量的20%～80%（李慶逵，1983）。當(dāng)pH低于5.0時(shí)，鋁以有毒的形態(tài)存在來(lái)引起作物毒害，故酸雨和鋁毒被認(rèn)為是南方地區(qū)農(nóng)作物生長(zhǎng)重要的限制因子之一（李學(xué)垣等，1995）。在我國(guó)，南方產(chǎn)區(qū)花生產(chǎn)量低于全國(guó)平均水平，與北方產(chǎn)區(qū)相比仍然存在較大的差距（魯清等，2017），故通過(guò)闡明花生受鋁毒害的機(jī)制，進(jìn)而選育耐鋁性品種來(lái)提高南方花生生產(chǎn)力愈發(fā)重要。研究表明花生受鋁毒害的部位主要是根尖，表現(xiàn)為根系生長(zhǎng)受抑制、線粒體功能受損、ROS迸發(fā)以及發(fā)生細(xì)胞程序性死亡等（詹潔等，2008；
徐芬芬等，2014；
Huang et al.， 2014）。花生響應(yīng)鋁毒害的機(jī)制主要包括外部排斥和內(nèi)部耐受兩種，這兩種機(jī)制中需要眾多成員參與來(lái)傳遞信號(hào)，發(fā)揮功能，最終使得花生響應(yīng)鋁毒害。
類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinases， RLKs）是一種由胞外域接收信號(hào)，后通過(guò)激酶域傳遞和激活下游信號(hào)通路完成胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酶活性受體（馬媛媛等，2005），在植物中廣泛存在，并可分為多個(gè)家族（Shiu & Bleecker， 2001a， b），參與眾多生長(zhǎng)代謝過(guò)程的調(diào)控，如參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程（Nibau & Cheung， 2011）、植物對(duì)病蟲害防御應(yīng)答（Yang & Ramonell， 2012）和植物抵抗非生物脅迫（Osakabe et al.， 2010）等。PRKs蛋白是一類富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）的RLK蛋白（Duckney et al.， 2017），首個(gè)PRK激酶是在矮牽牛中被發(fā)現(xiàn)，命名為PRK1，特異性分布在花粉中，并在減數(shù)分裂中發(fā)揮作用（Mu et al.， 1994）。擬南芥中的6個(gè)PRK成員也在花粉中高表達(dá)，并命名為AtPRK1-6（Chang et al.， 2013）。研究發(fā)現(xiàn)，PRKs在花粉管發(fā)育（Chang et al.， 2013；
Duckney et al.， 2017）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Huang et al.， 2014）和細(xì)胞死亡（Wrzaczek et al.， 2014）等方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，但關(guān)于PRKs在脅迫中的功能研究很少，僅在擬南芥的低水勢(shì)脅迫下研究發(fā)現(xiàn)，相較于野生型，突變體prk1會(huì)積累更多的脯氨酸來(lái)響應(yīng)脅迫（Verslues et al.， 2014），而PRKs在鋁脅迫下是否有響應(yīng)還未見(jiàn)報(bào)道。
RLKs通過(guò)磷酸化作用傳遞信號(hào)進(jìn)而響應(yīng)脅迫。在冷脅迫下，激酶OST1（OPEN STOMATA 1）活性被激活，通過(guò)磷酸化ICE1（Inducer of CBF expression 1）來(lái)增加該轉(zhuǎn)錄因子的蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而增強(qiáng)擬南芥對(duì)低溫的抵抗能力（Ding et al.， 2015）。CIPK26（CBL-interacting protein kinase 26）與RBOHF（respiratory burst oxidase homolog F）的N端存在相互作用，并且可磷酸化RBOHF來(lái)刺激ROS產(chǎn)生，進(jìn)而影響RBOHF在植物脅迫應(yīng)答中的調(diào)控（Drerup et al.， 2013）。SOBIR1（suppressorn of BIR1-1）激酶依賴于其蛋白濃度發(fā)生自磷酸化，其第529位的蘇氨酸以及β3-αC環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)磷酸化至關(guān)重要，并影響SOBIR1對(duì)煙草細(xì)胞死亡的調(diào)控（Wei et al.， 2022）。擬南芥CPK28（calcium-dependent protein kinase 28）可響應(yīng)擬南芥Ca2+信號(hào)路徑參與免疫反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)CPK28具自磷酸化活性，并隨著Ca2+濃度增加而活性增強(qiáng)，其中第318位絲氨酸是關(guān)鍵活性位點(diǎn)，盡管該位點(diǎn)突變不會(huì)影響CPK28調(diào)控營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)換，卻會(huì)對(duì)AtPep1引發(fā)的氧化應(yīng)激表現(xiàn)高敏性狀，同時(shí)對(duì)丁香假單胞菌具有更強(qiáng)的抵抗力（Bredow et al.， 2021）。這表明RLKs的磷酸化活性與這些蛋白在植物脅迫應(yīng)答中的作用密切相關(guān)。
通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘（Xiao et al.， 2021），我們發(fā)現(xiàn)花粉類受體蛋白激酶基因AhPRK4轉(zhuǎn)錄受鋁脅迫處理的誘導(dǎo)，并且在不同花生鋁耐性品種中有著不同的響應(yīng)模式，暗示其參與花生鋁脅迫響應(yīng)過(guò)程。本研究以AhPRK4的鋁脅迫響應(yīng)模式和蛋白活性為研究?jī)?nèi)容，采用qRT-PCR檢測(cè)了不同鋁濃度和處理時(shí)間條件下，AhPRK4在花生耐鋁品種‘99-1507和鋁敏感品種‘中花2號(hào)（‘ZH2）的轉(zhuǎn)錄變化，對(duì)AhPRK4胞內(nèi)域進(jìn)行克隆，并開展了原核表達(dá)分析，通過(guò)磷酸化抗體對(duì)其自磷酸化活性進(jìn)行檢測(cè)，擬探討以下問(wèn)題：（1）AhPRK4的鋁響應(yīng)模式；
（2）AhPRK4胞內(nèi)域的磷酸化狀態(tài)。為后續(xù)在蛋白質(zhì)水平上探究AhPRK4蛋白的生化功能以及在鋁脅迫下的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
供試花生品種由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室早期篩選鑒定出的鋁敏感品種‘中花2號(hào)（‘ZH2）和耐鋁品種‘99-1507（詹潔等，2008）。將花生種子經(jīng)濕潤(rùn)珍珠巖催芽3 d后，去除花生種皮并掐除約1 cm的主根根尖，在26 ℃條件下將材料置于改良的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)至第三片真葉長(zhǎng)出，轉(zhuǎn)移花生幼苗至100 μmol·L-1 CaCl2溶液（pH 4.2）中培養(yǎng)24 h，之后做以下兩種處理：一是用100 μmol·L-1 AlCl3溶液（含100 μmol·L-1 CaCl2，pH 4.2）分別處理花生幼苗4、8、12、24 h；
二是用不同濃度的AlCl3溶液（50、100、200、400 μmol·L-1）分別處理花生幼苗4 h和8 h。以上兩種處理均以改良的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理作為對(duì)照，取約1 cm的根尖作為實(shí)驗(yàn)材料。
1.2 RNA提取
先參照植物總RNA提取試劑盒（Promega）方法提取RNA，之后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）方法進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。
1.3 AhPRK4在鋁脅迫下表達(dá)量檢測(cè)
根據(jù)AhPRK4基因CDS（coding sequence）序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR檢測(cè)引物（表1），參照TB Green Premix Ex Tap II酶（Takara）說(shuō)明，設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)體系和程序，以UBQ10R為內(nèi)參，采用2-△△Ct法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的分析。
1.4 生物信息學(xué)分析
利用在線網(wǎng)站ProtParam tool預(yù)測(cè)AhPRK4的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)（https：//web.expasy.org/protparam/）；
通過(guò)WoLF PSORT來(lái)預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位（https：//wolfpsort.hgc.jp/）；
通過(guò)NCBI比對(duì)獲得其他物種對(duì)應(yīng)的基因序列，利用MEGA 7.0構(gòu)建進(jìn)化樹，并在軟件DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，同時(shí)通過(guò)NCBI Conserved Domain預(yù)測(cè)AhPRK4蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。對(duì)于目的蛋白的跨膜域以及信號(hào)肽分析分別通過(guò)在線網(wǎng)站TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 4.1 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）完成，同時(shí)對(duì)AhPRK4的磷酸化位點(diǎn)以及互作蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)，磷酸化預(yù)測(cè)軟件為iGPS 1.0，互作蛋白預(yù)測(cè)網(wǎng)站為STRING（https：//stringdb.org/cgi/input.pl？sessionId=K7gDcPsKo9E0&input_page_active_form=single_sequence）。AhPRK4啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)于PlantCARE在線網(wǎng)站進(jìn)行（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。
1.5 AhPRK4激酶域克隆和原核表達(dá)載體構(gòu)建
從NCBI上搜索得到AhPRK4的基因序列，運(yùn)用軟件PrimerPremier 5設(shè)計(jì)激酶域克隆引物（表1）。以‘ZH2根尖cDNA為模板，克隆獲得AhPRK4的胞內(nèi)激酶域，參照ClonExpressll One Cloning Kit試劑盒方法連接AhPRK4-CD至pGEX-6p-1載體（雙酶切位點(diǎn)為EcoR I和Xhol），熱激轉(zhuǎn)化至DH5α，將經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆菌株提取質(zhì)粒（AhPRK4-CD-pGEX-6p-1）。
1.6 AhPRK4蛋白的原核表達(dá)和純化
將AhPRK4-CD-pGEX-6p-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)至 OD600=0.6～0.8，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在16 ℃下誘導(dǎo)GST-AhPRK4-CD蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。參考Glutathione Sepharose 4B填料（GE公司）說(shuō)明純化AhPRK4-CD重組蛋白，并進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證。
1.7 GST-AhPRK4-CD自磷酸化檢測(cè)
加0.5 μg的GST-AhPRK4-CD蛋白到100 μL PBS磷酸緩沖液（含25 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol·L-1 MgCl2，10 mmol·L-1 MnCl2，1 mmol·L-1 DTT，1×蛋白酶抑制劑和1 mg·mL-1 ATP）中，以不加ATP為對(duì)照組，混合液于28 ℃下孵育10 min，并于100 ℃下孵育10 min變性，后取30 μL樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)膜依次用兔抗的酪氨酸磷酸化抗體（Cell Signaling公司）、蘇氨酸磷酸化抗體（Cell Signaling公司）以及鼠抗的GST抗體（康為世紀(jì)公司）孵育并化學(xué)顯色，根據(jù)對(duì)照組和處理組條帶差異判斷磷酸化及激酶活性。
2 結(jié)果與分析
2.1 AhPRK4在不同鋁處理時(shí)間、濃度下的表達(dá)
由圖1：A可知，‘ZH2和‘99-1507經(jīng)鋁處理不同時(shí)間后，與對(duì)照相比，AhPRK4的表達(dá)量均上升，但兩個(gè)花生品種中AhPRK4的表達(dá)趨勢(shì)有所差異，‘ZH2中，AhPRK4在4 h的表達(dá)量最高，8 h的表達(dá)量最低，隨后表達(dá)量則一直增加。‘99-1507中，AhPRK4表達(dá)量則先增加后降低，在12 h達(dá)到最高。由圖1：B，C可知，在經(jīng)不同鋁濃度處理4 h和8 h后，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)花生品種中AhPRK4的表達(dá)量隨著處理濃度的增加同樣呈先增加后降低的趨勢(shì)；
且在不同鋁濃度處理8 h時(shí)，AhPRK4在耐鋁性品種‘99-1507中的響應(yīng)比敏感性品種‘ZH2更劇烈。綜上所述，這些結(jié)果表明AhPRK4是鋁脅迫響應(yīng)基因。
2.2 AhPRK4的生物信息學(xué)分析
2.2.1 AhPRK4蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征及親緣關(guān)系的分析 分析AhPRK4（LOC112718333）的序列信息可知，該基因CDS（coding sequence）全長(zhǎng)為2 022 bp，編碼673個(gè)氨基酸。經(jīng)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)分子量為74.92 kD，理論等電點(diǎn)為6.06；
AhPRK4蛋白N端具多個(gè)亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，C端具絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，激酶域含有ATP結(jié)合位點(diǎn)，并與其他物種PRK成員的激酶域具較高的同源性（圖2）；
AhPRK4蛋白含有兩個(gè)跨膜域，屬于膜功能蛋白。因此，AhPRK4蛋白屬于具有跨膜域和信號(hào)肽的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。
進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果顯示AhPRK4獨(dú)立成一個(gè)分支，與比對(duì)的9個(gè)物種之間有較大的差異；
擬南芥中，AhPRK4與AtPRK1和AtPRK4有較高的同源性（圖3）。進(jìn)一步查詢花生LRR-RLK家族分類，AhPRK4屬于LRR-III蛋白激酶家族（Wang et al.， 2021）。經(jīng)預(yù)測(cè)AhPRK4具可磷酸化的氨基酸位點(diǎn)，包括絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）。因此，AhPRK4可能與AtPRK1和AtPRK4具相近的功能，可能發(fā)生磷酸化。
2.2.2 AhPRK4啟動(dòng)子分析和互作蛋白預(yù)測(cè) 經(jīng)花生基因組序列提取，得到AhPRK4基因ATG前長(zhǎng)2 000 bp的啟動(dòng)子序列。分析啟動(dòng)子元件，結(jié)果表明：AhPRK4的啟動(dòng)子元件包括生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、ABA響應(yīng)元件、 MeJA響應(yīng)元件等激素響應(yīng)元件，光調(diào)控元件，干旱脅迫響應(yīng)元件和60 K蛋白結(jié)合位點(diǎn)（圖4：A）。以擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)為篩選基礎(chǔ)，篩選AhPRK4的相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)AhPRK4可與多個(gè)蛋白存在互作，包括LMK1（leucine-rich repeat receptor-like kinase with extracellular malectin-like domain 1）、 ABCB16 （ATP-binding cassette B16）、PME30 （pectin methylesterase 30）、激酶AT1G34420（leucine-rich repeat transmembrane protein kinase family protein）、HAK1（HDS-associated RLK1）、PEPR2（PEP1 receptor 2）、AT1G12460（leucine-rich repeat protein kinase family protein）、AT1G24650（leucine-rich repeat protein kinase family protein）、FEI1、AT1G49100（leucine-rich repeat protein kinase family protein）（圖4：B），推測(cè)AhPRK4可能參與激素調(diào)控、細(xì)胞死亡、非生物脅迫應(yīng)答、生物防御、細(xì)胞壁膨大等調(diào)控過(guò)程。
2.3 AhPRK4激酶域克隆和原核表達(dá)載體構(gòu)建
以‘ZH2根尖cDNA為模板，克隆到AhPRK4胞內(nèi)域片段（AhPRK4-CD）（圖5：A），序列長(zhǎng)度為1 122 bp，與目的片段（LOC107470884）序列100%同源。連接AhPRK4-CD片段和pGEX-6p-1載體，獲得重組質(zhì)粒（AhPRK4-CD-pGEX-6p-1）（圖5：B）。
2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化
將含有AhPRK4-CD-pGEX-6p-1重組質(zhì)粒的Rosetta菌株在16 ℃、0.5 mmol·L-1 IPTG環(huán)境中培養(yǎng)，在約71 kD處發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的上清液中有加深的特異性條帶，表明其以可溶性的形式存在于上清液中（圖6）。GST-AhPRK4-CD重組蛋白用Glutathione Sepharose 4B填料純化，在結(jié)合后用PBS洗脫無(wú)明顯條帶（圖7：A），表明層析柱與GST-AhPRK4-CD重組蛋白結(jié)合較好，后經(jīng)Elution buffer洗脫后獲得了條帶單一且位置正確的目的條帶，表明GST-AhPRK4-CD重組蛋白已成功純化。將獲得的GST-AhPRK4-CD純化蛋白根據(jù)攜帶的標(biāo)簽蛋白經(jīng)特異性GST一抗孵育，進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證，可以發(fā)現(xiàn)在約71 kD處出現(xiàn)清晰的特異性目的條帶（圖7：B），表明GST-AhPRK4-CD重組蛋白純化效果較好。
2.5 重組蛋白體外磷酸化檢測(cè)
將純化的GST-AhPRK4-CD蛋白進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)，用磷酸化抗體檢測(cè)磷酸化水平，用GST抗體標(biāo)定上樣水平。由圖8可知，兩個(gè)磷酸化抗體孵育后，均能在目標(biāo)蛋白位置處檢測(cè)到條帶，磷酸化蘇氨酸抗體（anti-pT）有著更強(qiáng)的磷酸化信號(hào)，磷酸化酪氨酸抗體（anti-pY）信號(hào)較弱，表明該蛋白在原核誘導(dǎo)的過(guò)程中已經(jīng)發(fā)生了磷酸化修飾。但與對(duì)照組相比，ATP處理并未使得條帶有加深的現(xiàn)象（圖8），暗示AhPRK4-CD蛋白不存在體外自磷酸化活性。
3 討論與結(jié)論
目前對(duì)PRK家族在脅迫應(yīng)答機(jī)理的研究還未見(jiàn)系統(tǒng)的報(bào)道，僅在擬南芥突變體prk1缺水處理下發(fā)現(xiàn)，相較野生型來(lái)說(shuō)，該突變體會(huì)積累3.2倍的脯氨酸來(lái)響應(yīng)低水量脅迫（Verslues et al.， 2014）。前人研究也表明隨著鋁處理濃度的增加和鋁處理時(shí)間的延長(zhǎng)，花生根系游離脯氨酸的含量整體呈遞增的趨勢(shì)（徐芬芬等，2014）。本研究在對(duì)鋁處理下花生根尖AhPRK4轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)AhPRK4是一個(gè)鋁脅迫響應(yīng)基因，進(jìn)一步分析AhPRK4的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)其在兩個(gè)鋁耐性不同的花生品種中的表達(dá)模式不同，在不同鋁濃度處理下，AhPRK4表達(dá)水平均顯著提高，在鋁處理8 h后，在耐鋁品種‘99-1507中的表達(dá)上調(diào)更強(qiáng)烈，暗示AhPRK4是花生耐鋁相關(guān)基因，在鋁脅迫下，AhPRK4是否與AtPRK1功能類似而與應(yīng)激脯氨酸之間有關(guān)聯(lián)？有待進(jìn)一步研究。
AhPRK4蛋白與其他物種的PRK成員的激酶域具有較高的同源性，表明此結(jié)構(gòu)域在不同物種PRK以及同一物種不同PRK 成員的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹中，AhPRK4與AtPRK4以及AtPRK1在同一大分支上，具有較近的親緣關(guān)系，其中AtPRK4與AtNET2A互作共同參與微管運(yùn)動(dòng)來(lái)調(diào)控花粉管發(fā)育（Duckney et al.， 2017）， AtPRK1可在水勢(shì)脅迫下通過(guò)脯氨酸響應(yīng)脅迫（Verslues et al.， 2014），故AhPRK4也可能參與花粉管發(fā)育和響應(yīng)脅迫中。以AhPRK4的擬南芥同源蛋白AtPRK4的序列在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選預(yù)測(cè)AhPRK4的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)互作蛋白中以各類型激酶最多，同時(shí)預(yù)測(cè)AhPRK4具有磷酸化位點(diǎn)，故AhPRK4可能以磷酸化與各類型激酶之間形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在預(yù)測(cè)的互作蛋白中，部分蛋白功能已有報(bào)道，其中LMK1調(diào)控葉片死亡（Li et al.， 2020），HAK1可與PBL27蛋白互作參與HDS（herbivore-derived danger）防御反應(yīng)（Uemura et al.， 2020），PEPR2參與BSCTV（beet severe curly top virus）病害防御（Zeng et al.， 2020），推測(cè)AhPRK4在脅迫防御中起作用，進(jìn)一步驗(yàn)證其互作蛋白對(duì)探究AhPRK4在鋁脅迫中的響應(yīng)機(jī)制具有重要意義。除此之外，本研究對(duì)AhPRK4基因的啟動(dòng)子元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子區(qū)域含有生長(zhǎng)素和ABA響應(yīng)元件。生長(zhǎng)素在植物鋁脅迫響應(yīng)信號(hào)傳遞途徑中發(fā)揮作用，鋁脅迫下植物的生長(zhǎng)素在根尖的細(xì)胞分布和在細(xì)胞的運(yùn)輸可能會(huì)受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致根長(zhǎng)受到抑制（吳道銘等，2014）；
除生長(zhǎng)素外，在大豆鋁脅迫與ABA實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，大豆根尖內(nèi)源ABA與鋁處理時(shí)間和鋁處理濃度呈正相關(guān)關(guān)系，并且ABA處理可減少鋁脅迫下的氧化傷害（侯寧寧，2009）。故ABA和生長(zhǎng)素是否也調(diào)控花生鋁脅迫？有待進(jìn)一步研究。
AhPRK4屬于LRR-III類受體蛋白激酶家族的成員之一，具絲氨酸/蘇氨酸激酶域，并經(jīng)預(yù)測(cè)具有磷酸化位點(diǎn)，為了驗(yàn)證AhPRK4是否可發(fā)生磷酸化及探究AhPRK4的活性，本研究采用原核表達(dá)和親和柱層析的方法獲得AhPRK4-CD重組蛋白來(lái)探究其生物功能，在蛋白誘導(dǎo)過(guò)程中，16 ℃條件下可獲得較好的誘導(dǎo)效果。本研究已成功誘導(dǎo)并純化得到GST-AhPRK4-CD重組蛋白，體外磷酸化抗體孵育檢測(cè)AhPRK4-CD重組蛋白可以發(fā)生磷酸化修飾，但在酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化修飾水平極低，由于我們使用的磷酸化蘇氨酸抗體（Cell Signaling Technology，9381）對(duì)磷酸化絲氨酸殘基也有一定的識(shí)別能力，所以我們認(rèn)為AhPRK4-CD的磷酸化修飾主要發(fā)生在絲/蘇氨酸殘基上。在本研究中，我們未檢測(cè)到AhPRK4-CD的自磷酸化活性，一方面，可能是AhPRK4蛋白的自磷酸化活性較低，需要采用更靈敏的檢測(cè)手段，如同位素標(biāo)記等方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)；
另一方面，AhPRK4也可能是一種需要被其他因子磷酸化來(lái)共同發(fā)揮作用的輔助蛋白，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。
綜上所述，AhPRK4為鋁脅迫應(yīng)答基因，該基因啟動(dòng)子區(qū)域含有脅迫激素應(yīng)答元件，預(yù)測(cè)的互作蛋白也可在脅迫下起作用。在此基礎(chǔ)上，采用原核表達(dá)的技術(shù)成功誘導(dǎo)得到AhPRK4-CD純化蛋白，并驗(yàn)證其可以發(fā)生磷酸化修飾，為探究該蛋白在花生鋁脅迫中的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。
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（責(zé)任編輯 周翠鳴）
收稿日期：? 2022-08-16
基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金（31701356）。
第一作者：
蘇桂軍（1999-），碩士研究生，研究方向?yàn)樽魑锷恚‥-mail）su_guijun@163.com。
*通信作者：? 肖冬，博士，副教授，研究方向?yàn)樽魑锷砼c分子生物學(xué)，（E-mail）xiaodong@gxu.edu.cn。
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