萬應春 班義結 蔣鈺東 王亞欣 劉晶晶 劉曉晴 程育林 王 楠 馮 萍
水稻雄性不育突變體的表型鑒定與精細定位
萬應春1,**班義結1,**蔣鈺東2,**王亞欣1劉晶晶1劉曉晴1程育林1王 楠1,*馮 萍1,*
1西南大學水稻研究所 / 轉基因植物與安全控制重慶市市級重點實驗室 / 南方山地農業教育部工程研究中心, 重慶 400716;2四川省農業科學院水稻高粱研究所(四川省農業科學院德陽分院), 國家水稻改良中心四川瀘州分中心 / 農業農村部西南水稻生物學與遺傳育種重點實驗室, 四川德陽 618000
雄性不育材料是雜交水稻育種的關鍵。本研究通過甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)誘變優良秈稻保持系西農1B, 篩選得到一個雄性不育突變體。在營養生長階段與野生型無差異, 生殖生長階段表現雄配子不育, 雌配子發育正常。表型觀察發現,花粉完全破碎消失, 花藥外壁角質層異常, 花藥內壁烏式體排列異常, 胼胝質合成異常, 絨氈層凋亡異常, 且花粉外壁缺失柱狀層。遺傳分析表明該突變性狀受1對隱性核基因控制, 利用突變體與縉恢10號構建遺傳群體, 最終將基因定位于4號染色體引物標記N9和N11之間, 物理距離為74 kb, 該區間共15個預測基因, 通過重測序僅發現在的外顯子上發生了單堿基替換, 導致了翻譯的提前終止, 隨后對野生型和突變體該位點進行測序證實了這一突變, 因此將該基因確定為的候選基因,是一個未被報道過的新的雄性不育基因。本研究將為基因的功能研究奠定基礎。
水稻(L.); 雄性隱性核不育;; 精細定位
水稻是世界上主要糧食作物, 也是我國最重要的糧食作物之一, 同時水稻也是單子葉植物生物學研究的模式植物, 因此, 對于水稻的研究具有極為重要的應用價值和科學價值。雜種優勢是指雜交后代表現出優于親本性狀的現象, 在植物中廣泛存在, 將雜種優勢用于育種中能顯著提高作物的抗逆性和產量[1], 雄性不育材料是雜種優勢育種的關鍵。雄性不育是指不能產生可育雄配子, 而雌配子正常, 將雄性不育突變體應用于雜種優勢育種中, 可極大的提高育種效率, 目前在多種作物的育種中都有應用。
植物的育性涉及很多基因表達調控, 擁有極為復雜的調控網絡[2], 目前已克隆的不育基因中雄性不育基因占大多數[3]。已克隆的雄性不育基因涉及到的生物學過程包括花粉減數分裂、絨氈層降解、花粉壁形成、花藥開裂、花粉管伸長等, 其中又以核基因為主[4-5]。絨氈層是水稻花藥4層中的最內層, 它為花粉粒的發育提供保護和必需的營養, 并為花粉外壁的形成提供前體[6]。絨氈層在花粉母細胞形成早期初步開始形成, 在花粉母細胞減數分裂初期開始啟動細胞程序性死亡(programmed cell death, PCD), 絨氈層細胞逐步降解, 細胞質濃縮, 在成熟花粉時期完全消失, 絨氈層的PCD過程是小孢子發育所必須的, 它為小孢子提供胼胝質酶、孢粉素前體、同化物等[7]。在水稻中, 絨氈層的發育與降解十分重要, 絨氈層發育相關基因的異常會導致水稻小孢子的發育異常, 水稻中影響絨氈層形成的基因有OsMADS3、OsMADS8、MSP1、UDT1等[8-11], 這些基因的隱性突變會導致絨氈層的不完全發育, 最終導致雄性不育。而影響絨氈層降解的基因有TDR[12]、PTC1[13]、EAT1[14]、GAMYB[15]、OsUGE1[16]等, 這些基因的隱性突變會讓絨氈層PCD開始時期提前或延后, 不能在正確的時期為小孢子的發育提供所需物質, 最終導致小孢子發育異常。EAT1是一種在陸地植物中保守的基本螺旋-環-螺旋轉錄因子, 正調節水稻花藥絨氈層細胞的程序性細胞死亡,突變體的絨氈層PCD過程出現延遲,與互作, 調控絨氈層功能和花粉發育[14]。花粉粒被花粉壁包圍, 這可以保護雄性配子體免受各種環境壓力和微生物的攻擊, 也有利于授粉[17]。花粉壁是植物中最復雜的細胞壁, 由花粉外壁和花粉內壁兩部分組成, 花粉外壁和花粉內壁都有各種不同的組織模式[18]?；ǚ郾诘男纬墒且粋€復雜的過程, 涉及大量基因的生物學事件發生, 已報道的OsC6[19]、DPW[20]、DPW2[21]、DPW3[22]均參與了花粉壁的形成, 其中DPW3編碼一種保守的新的膜相關α整合素蛋白,參與初生外壁形成、花粉外壁形成、烏氏體發育和花藥角質層形成,植物的花藥表現出花藥表皮輪廓不均衡、烏氏體異常、胼胝質沉積和花粉壁形成缺陷, 導致花粉敗育和完全雄性不育[22]。由此可見, 植物育性發育過程的每個環節均有由多個基因組成的復雜調控網絡, 而對新的雄性不育基因的發掘將有助于我們解析這些復雜的調控網絡。
本研究通過EMS誘變秈稻保持系西農1B, 獲得了一個可以穩定遺傳的雄性不育突變體(tapetum and pollen abnormal 1)對突變體進行表型鑒定, 發現該突變體的絨氈層和花粉壁發育異常, 進一步對其遺傳分析和分子定位, 最終將定位在4號染色體上引物標記為N9和N11之間。對定位區間的基因進行分析, 發現該區間范圍內尚未有已報道的雄性不育基因, 因此, 本研究結果將為水稻雄性不育和育種提供理論依據和種質資源。
1.1 試驗材料
水稻(L.)背景材料為秈稻保持系西農1B(L.), 通過EMS誘變得到突變體, 經過多代自交, 突變性狀穩定遺傳。用秈稻恢復系縉恢10號與突變體雜交, 種植F1并收獲F2種子。本研究所用材料均由西南大學水稻研究所提供, 種植于西南大學歇馬試驗基地和海南南繁基地。
1.2 表型鑒定和花粉育性觀察
對野生型和突變體的全生育期的植株表型進行觀察, 并對成熟期的植株小穗、花藥進行照相, 對成熟花粉使用1% I2-KI溶液(0.6% KI, 0.3% I2, w/w)進行染色分析, 使用Eclipse E600561顯微鏡對花粉育性進行觀察并照相。
1.3 掃描電鏡概觀察
在前人的研究中將水稻花藥發育分為14個時期[23]。隨機取野生型與突變體花粉已完成填充的第13期的小穗, 輕輕用鑷子剝開穎殼暴露其花藥,借助顯微鏡用鑷子剝開花藥, 暴露其花藥內壁及花粉粒, 同時保留完整花藥。利用SU3500掃描電子顯微鏡(日立, 日本)在–20℃和5.0 kV的加速電壓下觀察整體花藥、花藥外壁、花藥內壁和花粉粒形態并照相。
1.4 半薄切片觀察
為了觀察野生型和突變體的花藥發育情況,我們選取第8～12期的花藥并包埋。將花藥置于由0.1 mol L–1PBS (pH 7.4)配置的2.5%戊二醛中4℃中固定24 h, 然后用1%四氧化鋨在0.1 mol L–1PBS (pH 7.4)中滲透2 h。隨后, 樣品用梯度乙醇(50%、70%、85%、95%、100%、100%和100%)脫水, 并包埋在SPI-PON 812樹脂中。使用EM-UC6切片機制備半薄切片(2 μm), 用0.5%甲苯胺藍染色, 并用Eclipse E600顯微鏡照相。
1.5 透射電鏡觀察
選取野生型和突變體第10期的花藥用半薄切片所述包埋方法包埋進樹脂中。使用EM-UC6切片機獲得超薄切片, 用醋酸鈾和檸檬酸鉛溶液染色, 并使用H-7500TEM進行觀察和照相。
1.6 石蠟切片與胼胝質染色
取第7～10期的野生型和突變體花藥置于FAA固定液中固定, 樣品用梯度乙醇(50%、70%、85%、95%、100%、100%和100%)脫水, 分別處理40 min; 將脫水完畢的花藥依次置于3∶1、1∶1、1∶3的無水乙醇和二甲苯的混合液中透明, 分別處理40 min; 逐漸加入石蠟進行替換, 直至完全替換為石蠟, 并使石蠟完全浸透材料。將包埋完成的材料用石蠟切片機切片以獲得石蠟切片。用純二甲苯脫去石蠟切片的蠟, 并用梯度乙醇(100%、95%、85%、70%和50%)和磷酸緩沖液進行復水, 用0.1%苯胺藍溶液對復水的材料進行染色, 用熒光顯微鏡觀察并照相。
1.7 遺傳分析與精細定位
利用突變體與縉恢10號雜交獲得F1代, F1代自交獲得F2代分離群體, 統計F2代不育性狀分離情況并分析, 選取F2代中不育單株進行初步定位與精細定位。利用CTAB法提取定位群體葉片DNA[24]。利用公開的水稻數據庫Gramene (http://www.gramene.org/)和水稻基因組研究計劃(http://rgp.dna.afrc.go. jp/E/publicdata/caps/index.html)開發多態性SSR (Simple Sequence Repeats)標記(表1), 對定位群體進行分子鑒定。PCR總體系為12.6 μL, 含1.25 μL 10×PCR buffer、1 μL 50 ng μL–1DNA模板、0.75 μL 25 mmol L–1MgCl2、0.5 μL 2.5 mmol L–1dNTPs、8.0 μL ddH2O、1.0 μL 10 μmol L–1引物、0.1 μL 5 U μL–1DNA聚合酶。PCR程序為94℃預變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃復性30 s, 35個循環; 72℃延伸10 min。PCR產物經10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 快速銀染后觀察[25]。利用親本和突變體群體構建基因池進行全基因組重測序, 使用MutMap進行分析, 比對親本與突變體在定位區間內的序列差異, 隨后對突變位點設計檢測引物對野生型與突變體進行測序比對(表1)。
1.8 相關基因表達分析
用植物總RNA提取試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術有限公司)提取野生型抽穗期各部位、野生型和突變體花藥第6～9期的RNA, 再用UeIris RT mix with DNase (All-in-One) (蘇州宇恒生物科技有限公司)反轉錄得到對應的cDNA。根據中國國家水稻中心數據庫數據(https://ricedata.cn/)設計定量引物(表1), 利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行實時熒光定量PCR, 檢測候選基因在野生型各部位的表達水平, 檢測、、、、、、和基因在野生型和突變體中表達量的變化。
全世界槭樹科植物超過200 種，我國已知分布有151種,占全世界槭樹種類的75%。河南自然分布的槭樹共有2 屬、23種、2亞種、9變種, 約占全國槭樹科植物種類的15%，但擴散成分豐富，過渡特征明顯[2]。其中既有華北五角楓、茶條槭等景觀價值很高的種類，也有河南杈葉槭、小杈葉槭等河南特有分布種類。
表1 本研究使用的部分引物
(續表1)
2.1 突變體tpa1的表型分析
在田間對野生型和突變體進行整個生育期的表型觀察, 發現突變體與野生型在營養生長階段沒有明顯差異, 而在生殖生長階段, 與野生型相比, 突變體表現出完全不能結實的表型(圖1-A, B)。為了觀察花藥整體形態, 將第13期花藥置于體視鏡下觀察, 野生型花藥顏色呈黃色, 每顆的4個花藥室飽滿, 而突變體花藥較野生型更為細小, 干癟, 顏色呈暗黃色(圖1-C, D, F, G)。為對花粉活性進行觀察, 我們利用1% I2-KI溶液對花粉進行染色, 發現野生型花粉圓潤飽滿, 被染色為黑褐色, 而突變體完全無花粉(圖1-E, H), 表明突變體的花粉發育異常。進一步通過掃描電鏡對后期花藥進行觀察, 與野生型相比, 突變體花藥更短, 花藥室更干癟(圖1-I, J)。野生型花藥外壁可觀察到網格狀的蠟質層結構, 突變體的花藥外壁較野生型更為光滑, 網格狀角質層不明顯(圖1-K, N)。對花藥內壁進行觀察, 野生型的花藥內壁有致密的排列整齊的烏氏體, 而突變體的花藥內壁烏氏體數量減少, 排布混亂(圖1-L, O)。剝開花藥, 野生型可見大量圓形飽滿的花粉粒, 而突變體只有少量干癟破碎花粉(圖1-M, P)。以上結果表明突變體花藥外壁角質層和內壁烏氏體都出現了異常, 并且最終不能形成花粉。
2.2 突變體tpa1花藥切片分析
為了進一步探究突變體花藥發育異常的原因, 對第8～12期的野生型和突變體花藥進行了半薄切片觀察。在第8b期, 野生型小孢子正在進行減數分裂的最后步驟, 形成四分體小孢子, 絨氈層開始變得濃縮, 此時突變體與野生型并無明顯差異(圖2-A, F)。在第9期時, 野生型絨氈層繼續降解, 進一步濃縮, 細胞變得不規則, 而突變體的絨氈層整體形態平整, 且比野生型更厚(圖2-B, G); 在第10期時, 野生型的絨氈層進一步發生降解, 明顯濃縮變窄, 小孢子開始變大空泡化, 而突變體的絨氈層開始降解, 出現不規則的形態, 依然比野生型更厚, 小孢子也開始空泡化, 但小孢子壁較野生型更為明顯(圖2-C, H)。在第11期時, 野生型和突變體的絨氈層降解程度增加, 野生型小孢子呈鐮刀形, 而突變體小孢子部分出現鐮刀形, 且小孢子壁更明顯(圖2-D, I)。在第12期時, 野生型小孢子開始正常填充淀粉, 而突變體不能正常進行填充, 小孢子逐漸破碎, 發生敗育(圖2-E, J)。以上結果表明突變體絨氈層降解異常且小孢子壁發育異常。為進一步觀察在絨氈層與小孢子壁的變化, 對第10期時野生型和的花藥進行超薄切片并在透射電鏡下進一步觀察。在第10期, 野生型的絨氈層細胞核結構基本消失, 細胞器減少, 小孢子外壁具備明顯的外壁外層、柱狀層、外壁內層3層結構(圖2-K～M)。而的絨氈層中也出現了降解的現象, 細胞質濃縮, 細胞器消失, 但還能觀察到擁有清晰核膜的細胞核和少量線粒體, 進一步觀察此時突變體的小孢子外壁可以發現, 由于缺少了柱狀層外壁外層與外壁內層貼合在一起(圖2-N～ P)。該結果表明突變體的絨氈層降解延遲, 且小孢子外壁柱狀層缺失, 最終導致了花粉的敗育。
圖1 野生型西農1B與突變體tpa1育性觀察與掃描電鏡觀察
A, B: 野生型和突變體植株; C, D: 野生型和突變體小穗; E: 野生型花粉碘染; F: 野生型去殼后小花; G: 突變體去殼后小花; H: 突變體花粉碘染; I～P: 掃描電鏡觀察; I, J: 野生型和突變體花藥; K: 野生型花藥外壁; L: 野生型花藥內壁; M: 野生型花藥剝開露出花粉; N: 突變體花藥外壁; O: 突變體花藥內壁; P: 突變體花藥剝開露出花粉。標尺: 10 cm (A, B); 1 mm (C, F); 0.5 mm (D, G); 0.1 mm (E, H); 100 μm (I, J); 10 μm (K～P)。
A, B:plants of wild type and mutant; C, D: spikelet of wild type and mutant;E: pollen iodine staining of wild type; F: spikelet of wild type; G: spikelet of mutant; H: pollen iodine staining of mutant; I–P: SEM observation; I, J: anthers of wild type and mutant; K: outer wall of wild type anther; L: inner wall of wild type anther; M: wild type anthers peeled out pollen; N: anther outer wall of mutant; O: the inner wall of anther of mutant; P: the anther of mutantpeeled and exposed pollen. Bar: 10 cm (A, B), 1 mm (C, F), 0.5 mm (D, G), 0.1 mm (E, H), 100 μm (I, J), 10 μm (K–P).
(圖2)
A～E: 野生型st8b～st12期花藥半薄切片橫切; F～J: 突變體st8a～st12期花藥半薄切片橫切; K～M: 野生型st10期花藥超薄切片透射電鏡觀察; N～P: 突變體st10期花藥超薄切片透射電鏡觀察。Ba: 柱狀層; BP: 雙核花粉; dMsp: 異常小孢子母細胞; Dy: 二分體細胞; E: 表皮; En: 內皮; ML: 中間層; MP: 成熟花粉; Msp: 小孢子母細胞; N: 細胞核; Ne: 外壁內層; Nm: 核膜; T: 絨氈層; Tds: 四分體; Ub: 烏式體。標尺: 200 μm (A～J); 2 μm (K, N); 1 μm (L, O); 0.5 μm (M, P)。
A–E: section-thin sections of wild type anthers from st8b–st12; F–J: section-thin sections ofanthers from st8b–st12; K–M: TEM of wild type st10 anther ultra-thin sections; N–P: TEM ofst10 anther ultra-thin sections. Ba: bacula; BP: binuclear pollen; dMsp: abnormal microspore mother cells; Dy: dyad cells; E: epidermis; En: endothelium; ML: middle layer; MP: mature pollen; Msp: microspore mother cells; N: nucleus; Ne: nexine; Nm: nuclear membrane; T: tapetum; Tds: tetrad; Ub: Ubisch body. Bar: 200 μm (A–J); 2 μm (K, N); 1 μm (L, O); 0.5 μm (M, P).
2.3 tpa1胼胝質染色
胼胝質是小孢子在有絲分裂前包裹在小孢子外的一類物質, 具有保護小孢子的作用, 有研究表明, 胼胝質的異常也會導致小孢子的敗育[26]。用0.1%苯胺藍對野生型和突變體胼胝質進行染色觀察。在第7期時, 野生型胼胝質信號集中在小孢子中間, 突變體的胼胝質信號較野生型更弱(圖3-A, E); 第8a期, 野生型胼胝質信號包裹著二分體小孢子, 突變體只能觀察到少量的微弱胼胝質信號(圖3-B, F); 第8b期, 二分體進一步分裂形成四分體小孢子,此時野生型中胼胝質信號存在于2個四分體小孢子的中間, 而突變體胼胝質信號較野生型更弱(圖3-C, G); 在第9期, 野生型胼胝質降解完全, 四分體小孢子完成釋放, 野生型與突變體都不能觀察到胼胝質信號(圖3-D, H)。以上結果表明胼胝質代謝出現異常。
2.4 TPA1基因的精細定位
用縉恢10號與突變體雜交得到F1代, F1代全部正常結實, 表明不育性狀受隱性基因控制。F1代自交得到F2代群體, F2代群體中出現明顯的分離。分別表現雙親性狀, 其中有1202株可育單株, 422株不育突變體, 遺傳分析表明可育表型與不育表型符合3∶1分離比, 表明的突變性狀受隱性單基因控制(表2)。選取F2代中10株正常株和30株突變株的DNA作為正常基因池和突變基因池, 利用本實驗室現有的平均分布于12條染色體的SSR引物對正常株和不育株的基因池進行連鎖及多態性分析。結果表明, 在4號染色體的分子標記R7和R8與突變位點連鎖, 通過突變單株驗證及分析, 將突變位點定位在R7和R8之間(圖4)。進一步在R7和R8之間開發多態性分子標記, 利用F2群體中422株突變體進行進一步精細定位, 最終突變位點定位在引物N9和N11之間, 物理距離為74 kb的范圍內, 根據谷類比較圖譜資源數據庫(http:// www.gramene.org/microsat)以及國家水稻數據中心(http://www.ricedata.cn/)的數據查閱得知, 該區間內有15個預測基因(圖4-A)。對這15個預測基因進行分析發現無已報道的育性相關基因, 表明可能是一個從未被發現報道過參與育性調控的基因(表3)。為了進一步確定突變位點所在基因, 利用基于基因組重測序技術的Mut-map方法, 對區間內的基因進行突變位點篩選, 僅在的一個外顯子處發現了一個堿基替換, 由“G”堿基突變為“T”堿基, 對應氨基酸由谷氨酸變為了終止密碼子, 導致了翻譯的提前終止(圖4-A, B)。為驗證該結果, 設計了該突變位點的檢測引物, 從親本中分別選取了10株野生型和10株突變體進行測序, 發現野生型均為AA或Aa基因型, 突變體均為aa基因型(圖4-C)。因此將定為的候選基因。
圖3 野生型與突變體tpa1胼胝質染色
A～D: 野生型st7～st9期胼胝質染色; E～H:突變體st7～st9期胼胝質染色。標尺: 200 μm (A～H)。
A–D: callose staining of wild type anthers from stages st7 to st9; E–H: callose staining of mutantanthers from stages st7 to st9. Bar: 200 μm (A–H).
表2 突變體tpa1的遺傳分析
表3 精細定位區間預測基因
(續表3)
圖4 TPA1基因的精細定位
A:初步定位與精細定位; B: 野生型與突變體重測序結果分析; C: 野生型與突變體突變位點測序結果。
A: preliminary positioning and fine positioning of; B: the resequencing results of wild type and mutant; C: wild type and mutantmutation site sequencing results.
2.5 相關基因表達分析
為探究在水稻各部位中的表達水平, 通過RT-qPCR分析了在水稻抽穗期各部位以及第6～11期的小穗中的表達水平, 結果表明,在葉、鞘和花藥中有較高水平表達, 而在花藥發育第6～12期中,的表達水平幾乎一致, 并沒有在某個時期特異高表達(圖5-A)。在表型分析中, 我們發現了突變體在絨氈層的發育上存在缺陷, 為了探究與哪些基因可能在同一途徑發揮功能, 對突變體中絨氈層發育相關基因做了RT-qPCR分析。結果表明,、和在野生型與突變體中表達量無明顯差異,、、在突變體第9期中表達量較野生型有明顯下降,在突變體中第7、8期表達量都明顯低于野生型。推測可能是與、、共同參與了絨氈層發育的調控, 且在調控過程中可能與有更緊密的聯系, 還有待進一步的探索(圖5-B)。
A:在野生型水稻抽穗期各部位以及第6～12期的小穗中的表達水平; B: 絨氈層發育相關基因在野生型與突變體第6～9期的表達水平。
A: the relative expression level ofgenes in different parts of heading stage and spikelets of st6–st12 in wild-type rice; B: the relative expression level of tapetum development-related genes in wild type and mutantat st6–st9 stage.
3.1 TPA1影響水稻育性
突變體在營養生長階段與野生型無明顯差異, 而生殖生長階段表現出完全不能結實, 進一步觀察發現,的花藥外壁存在缺陷, 花藥內壁烏氏體不明顯且排布不規則, 花藥絨氈層凋亡延遲, 胼胝質合成異常, 且花粉外壁缺失柱狀層, 這些綜合表現最終導致了的花粉敗育。絨氈層是植物花藥最內部的一層細胞, 它不光為小孢子的發育提供了保護, 也會在適當的時機提供營養物質和酶, 以保障小孢子的正常發育[27]。在花藥發育早期, 胼胝質依賴絨氈層進行合成, 而減數分裂時期, 絨氈層又通過分泌胼胝質酶調控胼胝質的正常降解, 以在合適的時候釋放四分體小孢子[28]。在突變體中, 在第7期胼胝質發生了異常, 胼胝質的含量明顯減少, 之后在第8a期和8b期時突變體中胼胝質含量都低于野生型, 表明突變體胼胝質的合成存在異常,的絨氈層可能在早期就出現了物質合成方面的異常。烏氏體是絨氈層上的一種細胞器, 參與了花粉外壁的合成, 主要包括孢粉素, 致密電子的轉運[29], 突變體中烏式體的減少且花粉外壁缺失柱狀層, 推測絨氈層的異常導致孢粉素等物質的合成與運輸出現了異常, 綜合因素導致了突變體花粉外壁柱狀層的缺失, 進而導致了花粉無法正常填充, 最終發生敗育。
3.2 TPA1是一個新基因
通過精細定位, 我們最終將定位于4號染色體上引物標記N9和N11之間, 物理距離約為74 kb, 在該區間共有預測基因15個, 隨后利用重測序技術在一個未被報道的基因的外顯子上發現了一處堿基替換, 該突變導致了翻譯的提前終止, 并且通過對野生型和突變體該位點進行測序, 證實了這一突變結果, 因此我們將定為的候選基因。通過對的注釋信息進行分析發現, 該基因全長12,594 bp, CDS序列長度為7848 bp, 共有14個外顯子, 突變體的突變位點位于第14外顯子上。對蛋白結構域進行分析, 共發現3個結構域, 包含1個位于N端的Npa1結構域和2個連續的位于C端的NopRA1結構域, 這些結構域都被注釋在60S核糖體大亞基發生過程中發揮重要功能。為了探究TPA1在水稻中可能的功能, 對TPA1同家族基因在其他物種中研究結果進行了分析, 在釀酒酵母中, IVA′NV等發現Npa1p在60S核糖體早期成熟過程中發揮重要作用[30]; Shan等[31]發現URB1在核仁中3′ETS rRNA的去除過程發揮功能, 缺失URB1會影響斑馬魚和小鼠的胚胎發育; He等[33]還發現URB1還通過影響核糖體的組裝進而影響了斑馬魚消化器官的發育[32]; 玉米中的突變體60S核糖體與40S核糖體積累出現異常, 導致籽粒長度減少。此外, 在已有的研究中, 核糖體合成相關蛋白的異常也可能會導致根、葉、育性以及胚胎發育的異常[34-37]。根據RT-qPCR結果,在葉、鞘和花藥中有較高水平表達, 而突變體僅出現了花粉發育的異常, 推測在水稻花藥中該基因的功能是保守的, 而在其余部位, 可能存在相同功能的基因。
3.3 TPA1影響花藥絨氈層發育
通過RT-qPCR結果我們發現, 在突變體中,的表達水平較野生型有大幅度下降, 根據Uzair等的研究, 突變體表現為絨氈層凋亡延遲,且花粉外壁外層不連續, 柱狀層缺失[38], 突變體與具有相似的絨氈層與花粉外壁表型, 但突變體絨氈層與花粉壁異常程度要弱于突變體, 因此推測與可能位于同一途徑參與調控絨氈層與花粉外壁的發育。同時我們也發現在突變體中第9期有明顯下降的基因還有和, 這2個基因均屬于BHLH轉錄因子家族, 都是參與絨氈層降解的重要轉錄因子[12,14], 且在之前的報道中認為,與和在同一途徑共同參與影響絨氈層, 但并不直接受這2個轉錄因子調控, 因此可能作為連接或與中間的途徑參與絨氈層的發育。
本研究鑒定了一個水稻雄性不育突變體, 相較于野生型, 其花藥外壁角質層減少, 烏氏體發育異常, 絨氈層凋亡延遲, 胼胝質減少, 花粉外壁柱狀層缺失, 表現出完全的雄性不育, 遺傳分析表明突變表型受1對隱性核基因控制, 分子定位將確定在4號染色體上引物標記N9和N11之間, 物理距離為74 kb, 該區間內共包含15個預測基因,通過測序將一個從未被報道的基因確定為的候選基因, 表明是一個新的水稻育性發育基因,可能與處于同一途徑, 參與絨氈層與花粉壁的發育。
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Phenotypic identification and fine mapping of male sterile mutantin rice
WAN Ying-Chun1,**, BAN Yi-Jie1,**, JIANG Yu-Dong2,**, WANG Ya-Xin1, LIU Jing-Jing1, LIU Xiao-Qing1, CHENG Yu-Lin1, WANG Nan1,*, and FENG Ping1,*
1Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops / Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China;2Key Laboratory of Southwest Rice Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Luzhou Branch of National Rice Improvement Center, Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences (Deyang Branch of Sichuan Academy of Agricultural Sciences), Deyang 618000, Sichuan, China
Male sterile material is the key to hybrid rice breeding. In this study, a male sterile mutantwas screened by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis of excellentcultivar Xinong 1B. There was no difference betweenand wild type at vegetative growth stage. At reproductive stage, male gametes were sterile and female gametes developed normally. Phenotypic observation showed that the pollen ofwas completely broken and disappeared, the stratum corneum of the outer wall of the anther was abnormal, the Ubisch body of the inner wall of the anther was abnormal, the callose synthesis was abnormal, the tapetum apoptosis was abnormal, and the outer wall of the pollen was missing bacula layer. Genetic analysis showed that the mutant trait was controlled by a pair of recessive nuclear genes. A genetic population was constructed using themutant and Jinhui 10. Finally,gene was located between the markers N9 and N11 on chromosome 4, with a physical distance of 74 kb. There were 15 predicted genes in this interval. Resequencing identified that only a single base substitution occurred in the exon of, leading to an early termination of translation. Subsequent sequencing of the wild-type and mutantconfirmed this mutation, thus identified the gene as a candidate gene for, indicating thatwas a new male sterile gene. This study will lay a foundation for the functional study ofgene.
rice (L.); male recessive nuclear infertility;; fine mapping
10.3724/SP.J.1006.2024.32043
本研究由重慶市研究生科研創新項目(CYS22224)和重慶市技術創新與應用發展專項重點項目(CSTB2022TIAD-KPX0014)資助。
This study was supported by the Chongqing Graduate Research and Innovation Project (CYS22224) and the Chongqing Technology Innovation and Application Development Special Key Project (CSTB2022TIAD-KPX0014).
馮萍, E-mail: 554180353@qq.com; 王楠, E-mail: wangnan_xndx@126.com
**同等貢獻(Contributed equally to this work)
萬應春, E-mail: wanyc1221@126.com; 班義結, E-mail: 2263889500@qq.com; 蔣鈺東, E-mail: 289482100@qq.com
2023-10-17;
2024-01-12;
2024-02-08.
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