李明睿 王婷 陳志超 王婷婷 何晴
(安徽省血液中心，安徽 合肥 230031)
在現(xiàn)有的血液篩查策略中，隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)的診斷依賴于在HBsAg 檢測呈陰性的個體的血液中檢測到HBV DNA[1]。
目前本科室使用的血液篩查核酸檢測(NAT)設備為Grifols 公司的Panther 檢測系統(tǒng)(使用Procleix Ultrio Elite 試劑)和Roche 公司的Cobas s201 檢測系統(tǒng)(使用Cobas TaqScreen MPX v2.0 試劑)。
在實際工作中，區(qū)別于Cobas s201 系統(tǒng)檢測出的核酸反應性標本可以得到明確的反應性項目，Panther 系統(tǒng)檢測出聯(lián)檢反應性的標本，鑒別檢測的結果可能為陰性。
血液篩查檢測中HBsAg 陰性且聯(lián)檢反應性鑒別陰性的標本并不符合OBI 的定義，可歸類于核酸重復檢測非反應性(non-reproducible reactivity，NRR)標本，已被廣泛報道[2]。
此類NRR 標本在高靈敏度的NAT 設備上只能得到病毒聯(lián)合檢測反應性的結果，無法重復鑒別檢測出具體感染病原體的項目，故也無法確認獻血者實際被哪種病毒感染或是否可能因核酸聯(lián)檢結果假陽性導致鑒別結果為陰性，對血液安全狀態(tài)的評估和獻血者的結果告知工作產(chǎn)生影響。
同時根據(jù)本站現(xiàn)行獻血者歸隊的策略，此類NAT 陽性標本的獻血者將被屏蔽，當獻血者再次獻血時被告知因NAT 陽性無法繼續(xù)獻血，導致獻血者對血液檢測結果產(chǎn)生疑問。
因此需要對NRR 標本的病毒感染狀態(tài)進行評估。
本站單核酸聯(lián)檢反應性標本鑒別檢測反應性結果主要以HBV DNA 為主[3]，據(jù)此，我們對NRR 標本中可能存在的HBV 感染展開補充檢測分析，通過對聯(lián)檢反應性鑒別陰性的標本補充單人份NAT(PCR 法)和乙肝血清學標志物的檢測，并與已檢出HBV DNA 的OBI 標本中HBV血清學檢測結果相比較，了解NRR 標本與OBI 標本在HBV 血清學特征和血清學模式組合的相關性，為評估NRR 標本中存在HBV 感染狀態(tài)和NAT反應性標本對應獻血者的歸隊方案提供實踐依據(jù)。
1.1 標本來源
2021 年1 月—2023 年1 月合肥市中心血站采集的經(jīng)HBsAg 金標試紙條、ALT 和Hb 初篩檢測且均符合《獻血者健康檢查要求》(GB18467-2011)的獻血者血液標本。
按照《血站技術操作規(guī)程(2019版)》要求排除溶血、脂血、不足量等不合格標本。
1.2 試劑與儀器
HBsAg 檢測試劑盒(北京萬泰公司，批號:B20201139；
瑞 士Roche 公 司， 批 號: 55923601、57759001、60851501)，抗-HBs 檢測試劑盒(北京萬泰公司，批號:R20210101B；
瑞士Roche 公司，批號:54179801、56377402、58558702)；
HBeAg 檢測試劑盒(北京萬泰公司，批號:X20201108B；
瑞士Roche 公司，批號:52898801、59736001)；
抗-HBe 檢測試劑盒(北京萬泰公司，批號:Z20201219B；
瑞士Roche 公司，批號:50665002、58450402)；
抗-HBc 檢測試劑盒(北京萬泰，批號:K20201211B；
瑞士Roche 公司，批號:55043901、55043902、60033301)；
NAT 試劑盒Procleix Ultrio?Elite(西班牙Grifols 公司，批號:702597，703037，703460，704273，704700，705173)；
NAT 試劑盒Cobas?TaqScreen MPX v2.0(瑞士Roche 公司，批號: G16011， G29865， H06828， H18062)。
Microlab STAR 液體處理工作站、FAME 24/30 全自動酶免分析儀(瑞士Hamilton 公司)；
Multiskan FC 酶標儀(美國Thermo 公司)；
Procleix Panther?System(西班牙Grifols 公司)；
E411 電化學發(fā)光儀、Cobas?s201 核酸檢測系統(tǒng)(瑞士Roche 公司)；
1300 SERIES A2 生物安全柜(美國Thermo 公司)。
1.3 方法
1.3.1無償獻血者的血液篩查
對所有無償獻血者的血液標本完成ALT 檢測、ELISA 檢測和NAT。
ALT 檢測采用速率法。
ELISA的檢測模式為雙試劑檢測，酶免初檢反應性標本用相同試劑對原血樣做雙孔復試。
NAT 采用6 份標本混樣檢測的混檢模式(MP6-NAT)或單標本的聯(lián)檢(combined ID-NAT)模式。
混樣模式篩查出HBV DNA 反應性的標本完成拆分/單檢(ID-NAT)以確定HBV DNA 反應性標本；
聯(lián)檢模式篩查出聯(lián)檢反應性標本。
NAT 中所有標本隨機選擇1 種NAT 模式完成篩查試驗，NAT 各系統(tǒng)內(nèi)每批次試驗均設立陰陽對照和室內(nèi)質(zhì)控，并通過儀器比對驗證。
隨機選擇部分ALT≤50 IU/mL、ELISA 無反應性、NAT HBV DNA 反應性或聯(lián)檢反應性、標本量可滿足補充檢測的NAT 單反應性標本納入研究范圍。
1.3.2NAT 單反應性標本的補充檢測和入組
納入研究范圍的NAT 單反應性標本中，TMA法聯(lián)檢反應性標本分別完成TMA 法鑒別檢測和PCR 法單檢。
2 種補充檢測的結果均無反應性的標本判定為NAT NRR 標本，納入NAT NRR 標本組；
2 種補充檢測的結果中任1 種方法檢測出HBV DNA 反應性即確證為NAT 重復檢測反應性(NAT reproducible reactivity，NAT RR)，與PCR 法檢測出HBV DNA 反應性標本一同納入OBI 標本組。
1.3.3HBV 血清標志物檢測
入組的全部標本采用ELISA 法或電化學發(fā)光法完成HBV 相關項目的血清學檢測，包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe 和抗-HBc。
1.3.4OBI 標本的判定
HBsAg 陰性，鑒別檢測或單人份NAT(PCR法)中任1 種方法檢出HBV DNA 反應性標本即判定為OBI 標本。
1.3.5NAT 反應性標本入組檢測流程
見圖1。
圖1 NAT 反應性標本入組檢測流程示意圖Figure 1 Schematic diagram of detection and grouping process for NAT reactive samples
1.4 統(tǒng)計學分析
使用SPSS26.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 單NAT 反應性標本檢測結果和待研究標本的選擇
2021 年1 月—2023 年1 月本站共檢測獻血者標本262 150 份，共檢測出單NAT 反應性標本234(0.89‰)份，其中Cobas s201 檢測系統(tǒng)檢出HBV DNA 反應性標本100 份，檢出率0.05%；
Panther 檢測系統(tǒng)檢出聯(lián)檢反應性標本134 份，檢出率0.20%。134 份聯(lián)檢反應性標本中鑒別出HBV DNA 反應性33 份，鑒別陽性率24.63%。
從Cobas s201 檢測系統(tǒng)檢出的100 份HBV DNA 反應性標本中隨機選取52 份標本，從Panther 檢測系統(tǒng)檢出的134 份聯(lián)檢反應性標本中隨機選取92 份標本，共144 份標本納入研究范圍。
2.2 聯(lián)檢反應性標本后續(xù)檢測的結果
92 份聯(lián)檢反應性標本完成TMA 法鑒別試驗，其中87 份標本補充PCR 法單人份檢測，結果見表1。
將不同鑒別結果的標本分組，補充PCR 法單人份檢測，結果見表2。
表1 聯(lián)檢反應性標本后續(xù)檢測結果Table 1 Results of follow-up testing of reactive samples of ID-NAT
表2 不同鑒別結果標本補充PCR 法單人份檢測的結果(n，%)Table 2 Results of supplemental PCR assays for samples with different discriminatory results(n，%)
2.3 NAT 單反應性標本的乙肝血清學檢測結果
根據(jù)補充檢測結果將納入研究范圍的144 份標本分為2 組，NRR 標本組53 份，OBI 標本組91份，全部完成HBV 相關血清學檢測，結果見表3。在NRR 標本組與OBI 標本組的血清學模式比較見表4。
NRR 標本組在模式1 和模式2 中的標本共7份，主要以聯(lián)檢低值的標本為主，S/CO 值為1 ～3的標本共有5 份，占比71.43%；
OBI 標本組中，12號標本的Ct 值偏高，鑒別結果的值偏低，提示可能是1 個HBV 低濃度標本，見表5。
表3 NRR 標本組與OBI 標本組血清學檢測結果比較(n，%)Table 3 Comparison of serological results between NRR group and OBI group (n，%)
表4 NRR 標本組與OBI 標本組的血清學模式比較(n，%)Table 4 Comparison of serological patterns between the NRR group and OBI group(n，%)
表5 HBV 血清學標志物檢測結果全陰和僅抗-HBs 陽性標本的HBV DNA 定性結果Table 5 HBV DNA results for HBV serological markers with all negative results and anti-HBs positive samples only
OBI 患者血清中的HBV DNA 經(jīng)常以極低的濃度存在，并可能存在機會性檢出的現(xiàn)象[1]。
提高NAT 靈敏度被認為是降低機會性檢出、提高檢出率的最佳選擇[4]。
本站目前使用的2 套NAT 系統(tǒng)的最低檢出限分別為2.3 IU/mL 和3.4 IU/mL，能夠篩選出低濃度的HBV DNA，NAT 反應性標本檢出率0.89‰，與倪修文等[5]報道的嘉興地區(qū)OBI 流行率0.89‰相近。
在NAT 反應性標本中，TMA 法聯(lián)檢反應性標本占所有聯(lián)檢標本的0.20%，與吳亞玲等[6]報道的0.22%相近。
TMA 法聯(lián)檢反應性的陽性率(0.20%)高于PCR 法的陽性率(0.05%)，但聯(lián)檢反應性標本鑒別試驗時，鑒別陽性率僅有24.63%，因此大量鑒別陰性的標本其病毒感染狀態(tài)需要確認。
為了盡可能降低復檢時病毒漏檢概率，我們對ELISA 陰性、聯(lián)檢反應性標本完成了TMA法鑒別檢測和PCR 法單人份檢測，同時檢測HBV DNA/HCV RNA/HIV RNA，篩選出2 種方法復檢均為陰性的NRR 標本。
通過對NRR 標本和檢出HBV DNA 的OBI 標本進一步補充HBV 血清學檢測，了解NRR 標本與OBI 標本在HBV 感染狀態(tài)上的相關性，并根據(jù)檢測數(shù)據(jù)討論血液篩查反應性獻血者歸隊的策略。
本研究中共87 份聯(lián)檢反應性標本完成1 次TMA 法鑒別檢測和1 次PCR 法單人份檢測，其中53 份標本在2 種方法的檢測中均表現(xiàn)為無反應性，占比60.92%。
與吳亞玲等[6]報道的69.06%相近。
根據(jù)鑒別結果將87 份標本分為鑒別HBV DNA 反應性的OBI 標本組和鑒別陰性標本組，2 組標本在PCR 法單人份檢測的檢出率并不一致，鑒別HBV DNA 反應性組中82.35%的重復檢出率遠高于鑒別陰性組的24.29%(表2)。
鑒別HBV DNA陽性組的標本使用PCR 法檢測共有3 份標本未重復檢出，可能與HBV DNA 持續(xù)低水平復制，血清中HBV DNA 水平很低有關[7]。
而鑒別陰性組中用PCR 法共檢出17 份標本HBV DNA 反應性，證實了部分鑒別陰性標本中存在HBV 感染。
綜合檢測結果，增加PCR 法復檢有利于降低鑒別檢測時HBV DNA 的漏檢概率，但TMA 鑒別法和PCR 法都存在一定的局限性，僅使用1 種方法檢測時存在漏檢的可能。
同時在實際檢測過程中，仍有較多聯(lián)檢反應性雙試劑復檢均為陰性的NRR 標本的病毒感染狀態(tài)需要被確認。
比較NRR 標本組和OBI 標本組的乙肝血清學檢測結果，2 組在抗-HBc 項目的陽性率上均無差異(表3、表4)，NRR 標本組86.79%的陽性率與OBI標本組94.51%的陽性率相接近，均遠高于國家疾控中心調(diào)查發(fā)布全國平均34.1%的陽性流行率[8]。抗-HBc 陽性提示HBV 現(xiàn)癥感染或既往感染，并且因半衰期較長，血液中存在持續(xù)時間也較長。
抗-HBc 經(jīng)常作為補充性的血清學標志物，輔助判斷獻血者的感染狀態(tài)[1]。
本研究中NRR 標本組中抗-HBc 的陽性率為86.79%。
與任亞娜等[9]報道的89.5%和鄧雪蓮等[10]報道的87.0%基本相符。
提示相當部分的NRR 標本仍存在HBV 感染的風險。在抗-HBs 項目的對比中，NRR 標本組的陽性率為64.15%，OBI 陽性標本組的陽性率為47.25%，抗-HBs 和抗-HBc 同時陽性的比例也要高于OBI 標本組，與葉賢林等[11]報道的2 組抗-HBs 陽性率60%和53.8%相近。
在抗-HBe 項目的對比中，NRR 標本組中抗-HBe 的陽性率相比OBI 陽性標本組低，而抗-HBe 陽性的標本其抗-HBc 結果均為陽性。抗-HBe 的出現(xiàn)多見于急性肝炎恢復期，也可見于慢性肝炎、肝硬化患者，常在HBsAg 接近消失或已經(jīng)消失時檢出，因此抗-HBe 陽性的獻血者也有較大可能存在HBV 暴露的風險。
2 組標本在抗-HBs和抗-HBe 項目的陽性檢出率存在差異(P＜0.05)，也在血清學模式的表現(xiàn)上有所區(qū)別。
在NRR 標本組中，表現(xiàn)最多的血清學模式為模式4(抗-HBs＋/抗-HBc＋)，其次為模式6(抗-HBs＋/抗-HBe ＋/抗-HBc＋)，而OBI 標本組中，表現(xiàn)最多的血清學模式為模式5(抗-HBe＋/抗-HBc＋)，其次為模式4(抗-HBs＋/抗-HBc＋)。
血清學模式的區(qū)別提示NRR 標本與OBI 標本在HBV 感染狀態(tài)上可能存在一定區(qū)別。
值得注意的是，2 組標本的血清學模式里均有2 份HBV 血清學標志物檢測全陰的標本。
鄧雪蓮等[12]發(fā)現(xiàn)HBV 血清學陰性獻血者中仍有46.8%可確認HBV DNA，本研究也驗證了血清學全陰的標本檢出HBV DNA 反應性(表5)。
因此對于NRR標本組和OBI 標本組出現(xiàn)的血清學全陰結果的標本無法簡單斷定為NAT 檢測假陽性，需要通過隨訪問詢和追加檢測進行HBV 感染的確認，同時也需要關注是否存在HCV 或HIV 早期感染的可能性。
2 組標本的HBV 血清學表現(xiàn)中，僅抗-HBs 陽性的標本例數(shù)也較接近，分別為NRR 標本組的5例和OBI 標本組的3 例。
抗-HBs 是1 種保護型抗體，常存在于HBV 感染后。
在抗-HBs 含量大于HBsAg 時發(fā)生血清學轉換，此時血液中能檢出抗-HBs 而無法檢出HBsAg，此時抗-HBs 的保護作用仍存在爭議，有研究指出病毒載量的波動可能會暫時突破血液中低水平的抗-HBs 導致HBV 的感染[13]。
此外隨著乙肝疫苗(HepB)接種率的提升，乙肝5 項組合中僅有抗-HBs 陽性也可能為接種疫苗所致，故無法直接確定抗-HBs 的來源，仍需要進一步隨訪問詢和補充試驗進行確認。
綜合HBV 血清學檢測的結果，本研究的NRR 標本組中約有13.20%的標本HBV 感染狀態(tài)需要進一步的確認，86.80%的標本存在抗-HBc 陽性和/或抗-HBe 陽性，提示可能已經(jīng)存在HBV 感染。
在李鳳園等[14]研究中“對NRR 標本完成HBV DNA 和HBV pgRNA 定量檢測，陽性檢出率26.67%”，從側面印證了NRR 標本中確實存在HBV 感染。
受條件限制本研究未完成NRR 標本對HBV DNA 定量檢測，也未完成NRR 標本對應獻血者的后續(xù)追蹤和隨訪工作，是本研究的不足之處。
綜上所述，血液篩查中NAT NRR 標本仍有可能存在HBV 感染風險。
對于聯(lián)檢反應性，復檢使用2 種核酸試劑檢測均為無反應性的標本，其HBV血清學檢測各項結果和模式特征與OBI 標本仍有較高的相似度，高比例的抗-HBc 陽性率仍提示NRR 標本中有相當比例存在HBV 感染。
分析其原因我們認為可能是該類標本的病毒濃度相對于檢出HBV DNA 的OBI 標本更低。
病毒顆粒在標本中呈Poisson 分布，病毒濃度越低，漏檢的概率越大[15]，在實際檢測中，無論TMA 法還是PCR 法的取樣過程均存在隨機性，檢測位點也存在一些差異，在面對低病毒濃度標本時2 種方法都存在一定的局限性。
因此聯(lián)合多種NAT 方法對NRR 標本進行檢測，有助于提升NRR 標本的病毒核酸檢出率。
從血液篩查反應性獻血者歸隊策略上考慮，我們認為通過PCR 法混樣＋拆分(單檢)或TMA 法聯(lián)檢＋鑒別檢測出HBV DNA 反應性標本，其獻血者暫不適合進入歸隊程序。
NAT 結果為聯(lián)檢反應性鑒別陰性標本對應的獻血者進入歸隊程序時，建議使用至少2 種方法不同的核酸試劑重復檢測歸隊標本，盡可能減少病毒漏檢的可能性。
同時建議補充HBV 血清學檢測，HBsAg 項目和抗-HBc 項目均能較好的提示獻血者可能存在的HBV 感染風險。抗-HBe 陽性多與抗-HBc 陽性同時存在，若在血清學檢測中檢測出HBsAg、抗-HBe 或抗-HBc 中任意1 項或多項陽性，我們認為該獻血者仍具有HBV感染風險。
在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，NRR 標本中HBV 血清學全陰或僅有抗-HBs 陽性的標本多見于聯(lián)檢S/CO 值較低的標本，對于此類標本是否可能為NAT 假陽性，或是否存在HCV 或HIV 早期感染狀態(tài)，此類獻血者的體內(nèi)真實感染狀態(tài)值得進一步評估。
有研究認為不同年齡段或不同職業(yè)的人群在HBV 感染率和HepB 的接種率上存在差異[16]，因此在隨訪中應關注獻血者的基本信息和是否接種過HepB 等關鍵信息的問詢，輔助評估血清學檢測抗-HBs 陽性的來源。
本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)NRR標本在補充檢測中篩查出與HBV 感染相關的指標陽性，因此建議要慎重考慮核酸項目的歸隊策略，即使面對可能是NAT 假陽性結果的獻血者，也要通過細致的問詢調(diào)查和完善的補充檢測結果來謹慎地評估能否歸隊。
血液篩查反應性獻血者歸隊策略應在盡可能保障臨床用血安全的前提下給予符合條件的獻血者重新評估的路線，并做好獻血者的檢測后結果解釋和追蹤服務工作。
若能通過追蹤或隨訪的方式找出可能因NAT 假陽性導致被屏蔽的獻血者并探尋出合理的歸隊方案幫助其返回無償獻血者隊伍，將有利于維護獻血者的個人權益和保持無償獻血者隊伍的穩(wěn)定，保護珍貴的血液資源。
猜你喜歡 獻血者陽性率陰性 [聚焦6·14]世界獻血者日來臨前，了解一下無償獻血流程吧人人健康(2021年11期)2021-06-17影響單采獻血者保留的相關因素分析人人健康(2019年17期)2019-09-16鉬靶X線假陰性乳腺癌的MRI特征中國醫(yī)學影像學雜志(2018年9期)2018-10-17三陰性乳腺癌的臨床研究進展中國醫(yī)藥指南(2017年3期)2017-11-13不同類型標本不同時間微生物檢驗結果陽性率分析中外醫(yī)療(2016年15期)2016-12-01分析重復獻血者與初次獻血者血液檢測結果比較中國繼續(xù)醫(yī)學教育(2015年6期)2016-01-07密切接觸者PPD強陽性率在學校結核病暴發(fā)風險評估中的應用價值結核與肺部疾病雜志(2015年1期)2015-07-18肌電圖在肘管綜合征中的診斷陽性率與鑒別診斷現(xiàn)代電生理學雜志(2015年1期)2015-07-18hrHPV陽性TCT陰性的婦女2年后隨訪研究醫(yī)學研究雜志(2015年12期)2015-06-10黃癸素對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的體內(nèi)外抑制作用中國藥理學通報(2014年2期)2014-05-09