付濤,林小雯,李欣培,Hasan M.B.
(1.西安博恩生物科技有限公司,西安 710077;2.西安交通大學 生命科學與技術學院,生物醫學信息工程教育部重點實驗室,西安 710049)
細菌感染已成為醫療中的一個重要公共衛生問題。目前,控制院內感染和防止植入型醫療器械表面形成微生物被膜最有效的方法是:在醫療器械表面涂覆抗菌涂層[1-2]。銀被證明是一種有效的抗菌材料,對多種耐藥菌具有廣譜抗菌作用[3]。研究者把銀添加到氣相沉積陶瓷薄膜,特別是類金剛石碳(diamond-like carbon,DLC)薄膜中,以期結合DLC膜優異的力學性能、良好的化學惰性及生物相容性和納米銀的優異抗菌功能[4-7],用于生物醫學領域。然而,銀在薄膜沉積和陳化過程中會從碳及其它陶瓷基體中析出[6,8-10],影響膜層的結構穩定性和生物相容性。
研究表明,在磁控濺射過程中加入乙炔、甲烷氣體,可以在DLC薄膜中引入C—H鍵,即產生氫化[8,11-13]。但是,乙炔前驅體對含銀DLC薄膜銀析出和抗菌性能的影響還未見報道。本研究采用磁控濺射方法制備了含銀的氫化DLC薄膜,通過控制乙炔流速和銀靶電流調節膜層顯微結構,著重探究了乙炔前驅體對薄膜表面形貌、顯微硬度和抗菌性能的影響。
本研究采用磁控濺射鍍膜機在拋光的316L不銹鋼片(11 mm×11 mm×0.5 mm)和硅片上沉積含銀的DLC薄膜。基體經過脫脂、超聲清洗后,在流動的氮氣中吹干,然后固定在樣品架上。鍍膜機含有3個石墨靶、2個鉻靶和1個銀靶(純度>99.9%)。基體經過等離子體清洗和沉積Cr-C中間層(厚約0.4 μm)后,沉積含銀DLC薄膜,參數分別為:氬氣流速80 sccm,石墨靶電流4.5 A,銀靶電流0、0.2、0.4和0.6 A,乙炔流速0、10、20、30和40 sccm,偏置電壓-60 V,基體支架轉速10 rpm。涂層試樣分別記為DLC(無氫薄膜)和SxCy(含氫薄膜,x、y分別代表銀靶電流和乙炔流速,見表1)。此外,本研究還制備了純銀薄膜試樣作為對照樣。
表1 DLC和含銀DLC試樣參數
采用色差計(CS-210)測定試樣的Lab值,其中L代表亮度;采用表面輪廓儀和臺階法(Bruker DektakXT)測量薄膜的厚度;采用掃描電鏡(SEM,Gemini 500)觀察表面形貌,并用電子能譜(EDX)檢測元素組成;采用拉曼光譜(背散射, 波長633 nm, 入射功率17 mW, Horiba Jobin YvonHR800)分析薄膜的顯微結構;采用顯微硬度計(Fischerscope H100C,維氏金剛石金字塔壓頭, 試驗載荷20 mN)測定薄膜的硬度。
大腸桿菌是一種典型的革蘭氏陰性菌,常見于生物材料相關感染部位,是醫院獲得性感染的來源之一。因此,本研究采用平板計數法評價薄膜試樣對大腸桿菌的抑菌性能。取50 μL大腸桿菌懸浮液加入到5 mL液體LB培養基中,過夜培養至對數期。將10 μL大腸桿菌懸浮液滴在紫外光滅菌后的試樣表面,并快速用無菌過濾膜覆蓋表面。在室溫下暗處放置3 h后,用3 mL滅菌水沖洗試樣,充分振蕩,收集存活的細菌。把100 μL的細菌懸浮液滴加在固體LB培養基上,用無菌涂布器均勻涂布,37 ℃有氧培養24 h后,觀察和拍照。DLC和銀膜試樣分別作為陰性對照和陽性對照。
2.1 結構和成分分析
所有試樣的膜層都具有良好的附著性,表面平滑。無氫DLC膜呈黑色,但加入銀后(試樣S0.2C0和S0.4C0),黑度有所降低,亮度值L見表1。在恒定銀電流(0.2和0.4 A)下,在沉積氣氛中加入乙炔前驅體,膜亮度降低,這與銀含量下降、乙炔引起膜層結構改變有關。其中,試樣S0.2C40的亮度最低(L=35.5),即黑度最高。然而,所有含銀試樣的亮度都較高,特別是試樣S0.4C0和S0.6C30,其銀靶電流/乙炔流速比相對較高。這表明在薄膜沉積(襯底溫度約120°C)和陳化期間膜層中的銀向表面析出,由表1可知,銀的析出也提高了薄膜的導電性。
薄膜試樣的拉曼光譜見圖1。可見,試樣DLC、S0.2C0、S0.2C10、S0.2C20和S0.2C30具有典型的DLC拉曼光譜,但是試樣S0.2C40的光譜受到激光照射產生的熒光信號的影響。D峰(約在1 350 cm-1)和G峰(約在1 550～1 600 cm-1)均是碳原子晶體的拉曼特征峰,D峰代表的是碳原子晶體的缺陷,G峰代表的是碳原子sp2雜化的面內伸縮振動[12,14]。采用XPS PeakFit軟件對拉曼光譜進行擬合,可得到G峰位置、半高寬(FWHM)和ID/IG面積比。隨著C2H2流量的增加(試樣S0.2C0-S0.2C30, 見表2),G峰變寬、向低波數移動,同時ID/IG比值下降。半高寬增加可能與sp2結合的碳簇平均晶體尺寸的下降有關[15]。而G峰向低波數移動、ID/IG比值下降,則可能表明隨著C2H2流量的增加,膜層的sp2/sp3比下降(即sp2鍵轉化為sp3鍵)[15-16]。相應地,隨著C2H2流量的增加,由于sp3鍵和C—H鍵含量升高,薄膜由導電變為不導電(S0.2C20-S0.2C40, 見表1)。
圖1 硅基體上DLC-Ag薄膜試樣的拉曼光譜
表2 DLC-Ag薄膜試樣的G峰位置、半高寬和ID/IG比
隨著銀靶電流的升高,薄膜的G峰位置、半高寬(FWHM)和ID/IG比呈現相反的變化趨勢(S0.2C30、S0.4C30和S0.6C30,見表2)。銀靶電流的升高將促進sp3鍵向sp2鍵的轉變,這與文獻[15]報道一致。相應地,由于銀含量和sp2鍵含量的增加,DLC-Ag薄膜從不導電轉變為導電(見表1)。
薄膜試樣的SEM表面圖像見圖2。可見,在銀靶電流0.2 A時,薄膜表面銀顆粒的尺寸和分布都不均勻。當乙炔流量為30 sccm時,銀顆粒數量和尺寸明顯減少,見圖2(a)、(b),這與文獻報道的銀顆粒數量和尺寸隨乙炔流量升高而降低的結果一致[11,17]。在銀靶電流升高到0.4 A時,由于膜層銀含量較高、銀顆粒距離近而發生Ostwald熟化,晶粒的長大使顆粒數量減少。因此,當乙炔流量為30 sccm時,銀顆粒的尺寸減小,但數量卻增多,見圖2(c)、(d)。色差測試時,薄膜的亮度與銀顆粒的反光現象有關。因此,L值與測試區域表面銀顆粒的總表面積相對應。特別地,試樣S0.4C30的銀含量(6.3 at%,見表1)僅為試樣S0.4C0(13.5 at%)的一半,但前者表面銀顆粒的總表面積和L值遠低于后者。當鍍膜氣氛中添加乙炔時,在試樣轉到銀靶對應位置時,銀和碳氫組分同時沉積,使得銀的擴散和析出得到有效抑制。
圖2 不銹鋼基體上薄膜試樣的SEM形貌
2.2 硬度和抗菌性能
銀和乙炔前驅體的加入降低了DLC薄膜的顯微硬度,但由表1可知,所有薄膜試樣的硬度都在820 HV以上,遠高于不銹鋼基體(約250 HV)。
本研究采用瓊脂平板計數法評價薄膜試樣對大腸桿菌的抗菌性能,材料與細菌的作用時間為3 h。測試結果見圖3,可見無氫DLC薄膜表面細菌能夠正常生長,含銀薄膜試樣S0.2C0、S0.2C30、S0.4C0和S0.4C30的細菌菌落明顯減少,且薄膜試樣S0.2C0、S0.4C0和S0.4C30的抗菌活性優于銀膜。銀納米顆粒可通過表面氧化釋放銀離子。銀離子進入細胞內,使細胞產生活性氧,起到抗菌作用。據報道,DLC-Ag薄膜在鹽溶液中可形成C-Ag微電偶,銀作為陽極,增強了銀離子的釋放[18]。
圖3 不銹鋼基體薄膜試樣對大腸桿菌的平板計數法抗菌測試結果
在DLC膜中加入銀會影響薄膜的力學性能、抗菌性能及細胞相容性。例如,把含銀DLC薄膜的銀含量提高到2 at%以上時,膜層對大腸桿菌有較好的殺菌性能,但成骨細胞的活性下降[6];用于促進骨整合的殺菌DLC涂層,其銀含量應不高于10 at%[7]。此外,由于銀在碳中的溶解度低,且二者無法形成碳化物,DLC-Ag薄膜在沉積和陳化過程中會形成復合結構。銀在薄膜表面的偏析和富集將改變DLC-Ag膜的外觀和生物學性能。本研究在沉積氣氛中添加乙炔,膜層中的銀被稀釋,使銀偏析得到有效抑制,有利于抑制膜層銀離子釋放、增強薄膜抗菌持久性和改善細胞相容性。
本研究在不同銀靶電流下,加入乙炔前驅體,采用磁控濺射法制備了DLC-Ag薄膜。隨著銀含量的增加,銀的析出增強、含銀薄膜更亮、導電性更好、硬度降低。乙炔前驅體的加入,降低了銀含量,抑制了銀析出,使含銀薄膜變暗,導電性下降。即使銀含量最低的試樣(0.8 at%)也表現出對大腸桿菌的良好抗菌性能。本研究的含銀DLC薄膜具有高硬度、高黑度和良好的抗菌性能,在生物醫學器件等領域將具有較好的應用前景。
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