黃瓊慶 梁珍貴 黃琪琪 歐超
作者單位：530000 南寧 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌的主要類型［1］，主要采用以手術為主并結合靶向治療、介入放射治療、中醫藥治療等的綜合療法［2］。隨著靶向治療和免疫治療在HCC 研究中不斷突破，其治療也取得了較大進展［3］。但HCC 患者的整體長期生存率仍然不容樂觀，5 年生存率僅約為18%［4］。而且，HCC 高復發率一直是臨床研究的難題。因此，尋找更有效的肝癌預測標志物對監測其復發和揭示新的治療靶點至關重要。
壞死性凋亡是一種以Caspase 非依賴的方式調節的壞死性細胞死亡，主要由受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）和混交激酶域蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）介導，并被壞死性凋亡抑制劑（necrostatin-1，NEC-1）抑制，在腫瘤發生、腫瘤轉移、抗腫瘤免疫等腫瘤生物學調節中發揮重要作用［5-6］。人類基因組只有大約2%的RNA被編碼成蛋白質。在非編碼RNAs 中，超過200 個堿基的被定義為長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）。在HCC 中，lncRNAs 可以通過招募、引導等在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平調節基因的表達，并參與腫瘤的增殖、凋亡、轉移和其他生物學活動［7-8］。因此，進一步闡明壞死性凋亡相關的長鏈非編碼RNAs（necroptosis-related long non-coding RNAs，NRLs）與HCC的關系對探索HCC的新治療靶點和改善患者預后具有重要意義。然而，目前NRLs在HCC中的研究有限。
本研究基于NRLs 構建HCC 風險預后模型，并進一步探索可能的作用機制。在治療方面，本研究分析了不同風險組之間免疫浸潤和免疫檢查點的差異，以期為HCC患者應用免疫治療提供理論基礎。
1.1 數據集
從TCGA 數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）獲得轉錄數據RNA 序列和臨床數據（TCGA-LIHC）。隨后，在GSEA（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）獲得壞死性凋亡相關基因（necrosis-related genes，NRG）集，并結合以往文獻［9］，共獲得67 個NRG。隨后通過Pearson 相關分析67 個NRG 與所有lncRNAs的表達水平之間的相關性，獲得NRLs（r＞0.4 和P＜0.001）。篩選條件：|log2FC|＞1 和P＜0.05。采用“LIMMA”包和“BiocManager ”包分析NRLs 在HCC 癌組織及癌旁組織中的表達，并繪制火山圖。
1.2 NRLs風險模型的構建
獲得343 例具有完整生存信息的HCC 樣本，將整個數據集按1∶1 的比例分為訓練集和測試集，其中訓練集用于構建風險模型，測試集用于驗證風險模型。通過單因素Cox 回歸分析獲得與HCC 患者預后相關的NRLs，然后通過最小絕對收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）和多因素Cox回歸構建風險評分預后模型。
1.3 NRLs風險模型的評估
采用“timeROC”包繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）評估模型的區分度。采用“survival”和“survminer”包進行生存分析。根據訓練集中的風險評分中位數將患者分為高風險組、低風險組，并采用Log-rank 檢驗比較高風險組、低風險組之間總生存期（overall survival，OS）的差異。采用多因素Cox 回歸分析，確定風險評分是否可作為預測肝細胞癌患者預后的潛在獨立指標。
1.4 生信分析
采用GSEA（Kegg.v7.5.1，symbs.GMT）進行通路富集分析，以識別高風險人群中顯著活躍的信號通路（P＜0.05 和FDR＜0.05）。腫瘤微環境分析方面，使用單一樣本GSEA 對HCC 中的免疫細胞和免疫功能評分，并用“GSVA”包對其進行定量分析。最后使用“ggpubr”包比較不同亞型患者的免疫檢查點激活情況。
1.5 qRT-PCR檢測NRLs在HCC細胞中的表達水平
用Trizol 試劑（Invitgen，美國）提取純化的細胞總RNA。使用RR047A（Takara，日本）試劑進行逆轉錄。使用熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒（ChamQUniversal SYBR QPCR Master Mix）（Vazyme，中國）和PCR擴增儀（ABI7500，美國）進行熒光定量聚合酶鏈式反應。反應體系：2"ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 10 mL、Primer1（10 mmol/L）0.4 mL、Primer2（10 mmol/L）0.4 mL、Template DNA 2 mL、ddH2O 7.2 mL。PCR擴增儀設置實驗條件：預變性95 ℃30 s、變性95 ℃5s、退火60 ℃30 s，40 個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法計算各細胞中NRLs 的表達量。引物序列如下：AL117336.2forward primer 5′- TGTTGCTCTGGCTGATCTTGAACTC-3′ ，reverse primer 5′-GCTAGGTGTGGTGGCTCATACTTG-3′；
LINC01224forwardprimer 5′-CCAGGTCTTCAGATTCCACCACTTG-3′，reverse primer 5′-AGAAAGGCGGGACAACTCAAAGC-3′ ;FOXD2-AS1forward primer 5′- TGGGTTGAGGGTCTGTGACTGTAG-3′，reverse primer 5′-GCTGCCGCTGGAGTATTCTTGG -3′;MKLN1-ASforward primer 5′-TGGTGGTGTTTCTCTCTGAAAGCAG-3′，reverse primer 5′- ATGGCAGCGGAGTCCTCAAGG -3′;β-actinforward primer 5′-GACCTGACTGACTACCTCATGAAGAT -3′，reverse primer 5′-GTCACACTTCATGATGGAGTTGAAGG-3′。
1.6 統計學方法
數據的處理與分析由R 4.2.1 軟件通過合適的軟件包完成。計量資料的多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。
2.1 差異表達的NRLs
從TCGA 數據庫中獲得424 例HCC 患者的轉錄RNA 序列和臨床病理信息，其中343 例具有完整臨床特征的樣本用于后續分析。對67個NRG 進行共表達分析，最終得到了791 個NRLs（r＞0.4 和P＜0.001），見圖1A。火山圖顯示，791個NRLs中有9個表達下調，其余表達均上調（均P＜0.001），見圖1B。
圖1 NRLs的差異表達Fig.1 Differential expression of NRLs
2.2 NRLs風險模型的構建
單因素Cox回歸篩選出17個與HCC患者OS相關的NRLs（均P＜0.001），見圖2A。17個NRLs在HCC組織中的表達水平均高于正常組織，見圖2B。將343例HCC 樣本按1∶1 的比例隨機分為訓練集（n=172）和測試集（n=171），訓練集和測試集的一般資料詳見表1。隨后在訓練集中，采用LASSO-Cox 回歸分析，同時設置10倍交叉驗證，以獲得最優模型，見圖2C、圖2D。該模型由4個NRLs（MKLN1-AS、FOXD2-AS1、AL117336.2、LINC01224）組成。HCC 患者的風險評分=1.758×MKLN1-AS+0.322×FOXD2-AS1+0.698×AL117336.2+0.585×LINC01224。
表1 訓練集和測試集的一般資料Tab.1 General information on training and testing sets
圖2 NRLs預測模型的構建Fig.2 Construction of predictive model base on NRLs
2.3 NRLs風險模型的評估
基于訓練集的多因素Cox 回歸分析顯示，校正其他臨床病理特征后，風險評分是獨立預后因素（HR=1.275，P＜0.001），見圖3A。在訓練集中，風險模型預測1、3、5 年OS 的AUC 分別為0.816、0.747、0.752，在驗證集中分別為0.713、0.621、0.626，見圖3B、圖3C。根據風險評分中位數（0.865）將訓練集和測試集的患者分為高風險組、低風險組。散點圖顯示，高風險區域的紅點更密集，見圖4A。提示高風險組患者具有更高的風險評分、更短的生存時間。生存分析顯示，在訓練集和測試集中，高風險組的OS 均低于低風險組（均P＜0.05），見圖4B。
圖3 NRLs風險模型的預測價值Fig.3 Predictive value of NRLs risk models
圖4 不同風險組患者的預后差異Fig.4 Prognostic differences among different risk groups
2.4 通路富集與免疫相關功能的差異分析
利用GSEA 軟件篩選出10 條在高風險人群中功能顯著豐富的信號通路（均P＜0.05，FDR＜0.05）。其中與免疫功能相關的有3 條信號通路：包括內吞作用、囊泡轉運中的相互作用和黏附連接，其余7 條信號通路均為癌癥相關信號通路，見圖5A。此外，使用ssGSEA 量化免疫細胞、免疫功能與風險模型之間的關系。結果發現高風險組的巨噬細胞、T 調節細胞（Treg）和MHC-Ⅰ類分子的表達水平更高，免疫得分更高；
而低風險組的B 細胞、中性粒細胞、NK 細胞、肥大細胞、Ⅰ型和Ⅱ型干擾素應答表達水平更高，免疫得分更高，見圖5B、圖5C。所有免疫檢查點在高風險組中都顯示出較高的活性，如TNFRSF14、CD27 和LGALS9（圖5D），這意味著高風險組患者的免疫活性更高，對免疫治療更敏感。提示可根據HCC 患者的NRLs 風險模型分組選擇合適的免疫檢查點抑制劑來治療。
圖5 通路富集和免疫相關功能分析Fig.5 Pathway enrichment and immune-related function analysis
2.5 NRLs在HCC細胞中呈高表達
qRT-PCR 結果（圖6）顯示，在正常肝細胞MIHA和HCC細胞Huh7中檢測NRLs的表達，結果顯示，4 個NRLs（MKLN1-AS、FOXD2-AS1、AL117336.2、LINC01224）在HCC細胞中均表達上調（均P＜0.01）。
圖6 NRLs在MIHA和Huh7細胞中的表達差異Fig.6 Differential expression of NRLs in MIHA and Huh7 cells
目前，HCC 患者的OS 往往因為復發、轉移而縮短［10］。因此，提前評估患者的預后信息對選擇適合的治療方案和隨訪方案具有重要價值。最近的研究發現，壞死性凋亡與HCC進展相關，例如在HCC 細胞中引入過量的山梨糖醇脫氫酶，發現其可通過增強壞死性凋亡信號來抑制腫瘤生長和干性［11］。因此，壞死性凋亡相關途徑可能是腫瘤治療的潛在靶點，但目前NRLs 在HCC 中的作用機制尚不清楚，因此構建可靠的HCC預后預測模型可能成為改善預后的關鍵。
本研究篩選出對HCC預后有價值的4個NRLs（包括MKLN1-AS、FOXD2-AS1、AL117336.2 和LINC01224）來構建NRLs 風險模型。根據現有文獻，MKLN1-AS在HCC 發展中起促進作用［12］。而FOXD2-AS1 可通過調節miR-206/MAP3K1 軸而加速HCC 進展［13］。LINC01224 則通過與miR-485-5p 特異性結合促進咽鱗狀細胞細胞癌的增殖和侵襲能力［14］，但LINC01224在HCC中的作用機制尚未被報道。AL117336.2在既往研究中未見報道，該基因可能是HCC潛在的治療靶點。
為證明NRLs 風險模型的實用價值，本研究進一步將所有的HCC 樣本以1∶1 比例隨機分配到訓練集和測試集中，并根據中位風險評分將患者分為高風險組、低風險組，以驗證所構建的NRLs風險模型的預后價值。本研究結果顯示低風險組患者的預后優于高風險組，此外在校正潛在混雜因素后，多因素Cox回歸表明該風險評分是預測HCC 患者生存的獨立預后因素，ROC 曲線表明本研究構建的NRLs 風險模型對患者的1、3、5 年OS 具有較好的預測能力。
此外，本研究還篩選出10 條在高危人群中功能顯著豐富的通路，這為后續的機制研究提供了方向。越來越多的證據表明，腫瘤細胞的壞死性凋亡通過在腫瘤微環境中釋放細胞因子和趨化因子來驅動癌細胞和免疫細胞之間的相互作用，從而參與癌癥相關的免疫反應［15-16］。本研究發現不同風險組人群的免疫狀態不同，其中低風險組的免疫細胞（即B 細胞、中性粒細胞、NK 細胞、肥大細胞）和免疫功能（即Ⅰ型和Ⅱ型干擾素應答）處于活躍狀態，在高風險人群中，免疫細胞（即巨噬細胞、T 調節細胞）和免疫功能（即MHC-Ⅰ類）處于活躍狀態。先前的研究表明，T 細胞和NK 細胞在HCC 中浸潤增加是一個有利的預后因素［17-19］；
而T 調節細胞浸潤增加的免疫微環境的腫瘤往往預后較差［20-21］。
現有的報道顯示，不同的免疫狀態與腫瘤微環境有關，從而導致不同的預后和免疫治療反應［22］。在HCC和其他癌癥中，免疫檢查點通過在腫瘤和間充質細胞中表達相應的配體來逃避抗腫瘤免疫反應。一些抗免疫檢查點療法，如程序性細胞死亡蛋白1 或細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白是抗腫瘤免疫所必需的免疫調節分子家族的成員，目前被批準用于治療實體腫瘤，如黑色素瘤、肺癌、頭頸癌等［23-25］。本研究根據NRLs 風險模型分析了不同分組免疫檢查點的差異，提示NRLs 風險模型能為HCC 患者進行個體化免疫治療提供參考。
本研究存在一定的局限性：⑴本研究僅在公共數據集TCGA 中獲取臨床樣本數據，獲得的數據仍有限；
⑵腫瘤樣本和正常樣本的比例不平衡，這可能影響通路富集的分析精度；
⑶本研究僅利用qRT-PCR驗證4 個NLRs 在HCC 細胞中的表達，后續仍需更多的臨床數據和進一步的實驗進行驗證。
綜上，本研究構建了一個基于NRLs 的HCC 預后模型并驗證了其預測能力，該模型對指導臨床治療具有潛在的價值。此外，模型中的關鍵基因可能是HCC潛在的生物標志物。
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