張 俊,黃冬梅,黃宣運,史永富,王 媛,田良良
(1.上海海洋大學 食品學院,上海 201306;2.中國水產科學研究院東海水產研究所,農業農村部水產品質量安全控制重點實驗室(上海),上海 200090)
甲霜靈常作為一種在農田中使用的殺菌劑,主要用于治療黃瓜、番茄、馬鈴薯等作物的霜霉病、黑胚病以及晚疫病[1-2]等,已被使用40余年[3],甲霜靈的殘留問題及其危害性也日益凸顯。國外研究表明,甲霜靈對于暴露于其中的人淋巴細胞具有基因毒性[4]。因此,在國家標準GB 2763—2021[5]中規定了洋蔥、花生仁、糙米和葡萄等農產品及其加工制品中甲霜靈的最大殘留限量,為0.05～5.0 mg·kg-1。但是甲霜靈在水產上的相關研究不多,其在2017年才被批準為新型漁用藥物,獲得新獸藥證書,在水產養殖中主要是作為孔雀石綠的替代藥物,用于治療養殖魚類的水霉病,但未有相關水產品的殘留限量規定。因此,亟需建立相應的甲霜靈檢測方法對水產品的質量安全進行監測,同時為制定水產品中殘留限量提供方法依據。
目前甲霜靈殘留量的檢測方法包括酶聯免疫吸附法(ELISA)[6-7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]、氣相色譜法(GC)[9-10]和氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[11-13]等,但是這些方法的檢測基質多為果蔬類等農產品,很少針對水產品。水產品具有高脂高蛋白的特點,與基質成分較為簡單的果蔬類差別較大,二者檢測方法之間不具有通用性。文獻[14]開發了基于單克隆抗體的膠體金試紙條,用于測定水產品草魚、凡納濱對蝦等中的甲霜靈含量,但方法的檢出限較高,為2 mg·kg-1,無法滿足高靈敏定量檢測的要求。液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、檢出限低等特點,作為陽性樣品復檢的指定檢測方法之一,對于快速檢測方法初篩結果不確定的樣品可做到精準的定性定量檢測。本工作提出了液相色譜-串聯質譜法測定多種水產品中甲霜靈的殘留量,針對水產品復雜基質,可兼顧凈化效果的同時縮短前處理時間,實用性強。另外,采用甲霜靈-d6作為內標可提高結果準確度,該方法能夠實現大批量水產品中甲霜靈殘留的痕量檢測。
1.1 儀器與試劑
DIONEX UltiMate 3000 RS Pump-UHPLC Focused型超高效液相色譜儀;TSQ Quantum Access型三重四極桿串聯質譜儀,配有電噴霧離子(ESI)源;Genius 3型旋渦混合器;16RⅫ型高速冷凍離心機;VisiprepTM DL固相萃取裝置;N-EVAPTM 112型氮吹濃縮儀;Milli-Q型超純水機;Agela Cleanert S C18固相萃取柱(6 mL,500 mg);0.22 μm針式水相尼龍濾膜。
單標準儲備溶液:100 mg·L-1,分別準確稱取甲霜靈、甲霜靈-d6標準品,用乙腈溶解并定容,配制成質量濃度為100 mg·L-1的單標準儲備溶液,于-18 ℃冰箱冷凍避光保存。臨用前分別用乙腈稀釋,配制成質量濃度為1.0 mg·L-1的甲霜靈、甲霜靈-d6標準溶液,于4 ℃冰箱避光保存。
甲霜靈、甲霜靈-d6標準品的純度不小于98%;乙腈、正己烷為色譜純;試驗用水為超純水。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 色譜條件
SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱(100 mm×2.0 mm,3.0 μm);流動相A為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為乙腈;流量 0.3 mL·min-1;進樣量 10 μL;柱溫 40 ℃。梯度洗脫程序:0～1.50 min時,B為10%;1.50 ～4.00 min時,B由10%升至90%,保持2.50 min;6.50～6.67 min時,B由90%跳轉至100%,保持1.33 min;8.00～8.17 min時,B由100%跳轉至10%,保持1.83 min。
1.2.2 質譜條件
ESI源,正離子(ESI+)掃描方式;選擇反應監測(SRM)掃描模式;離子噴射電壓 4 500 V;掃描時間 50 ms;離子傳輸管溫度 320 ℃;鞘氣流量 6.7 L·min-1,輔助氣流量 3.3 L·min-1。其他質譜參數見表1。其中,“*”代表定量離子。
表1 質譜參數
1.3 試驗方法
1.3.1 樣品制備
試驗所用鯽魚、羅氏沼蝦、中華絨螯蟹、河蚌采自上海,均參照GB/T 30891—2014[15]制備樣品,于-20 ℃冷凍保存。
1.3.2 樣品提取
準確稱取(5±0.05)g樣品,加入10 ng的內標甲霜靈-d6,靜置10 min,加入10 mL含1%(體積分數,下同)乙酸的乙腈溶液,以轉速2 500 r·min-1渦旋混合5 min,于4 ℃以10 000 r·min-1高速離心10 min,取上清液于20 mL刻度玻璃管中,于45 ℃氮吹濃縮至0.5 mL以下。向玻璃管中加入7.5 mL 20%(體積分數,下同)乙腈溶液,混勻。以轉速2 500 r·min-1渦旋1 min,轉移至50 mL塑料離心管中,待凈化。
1.3.3 樣品凈化與濃縮
加入7.5 mL正己烷,以轉速2 500 r·min-1渦旋混合1 min,于4 ℃以10 000 r·min-1高速離心10 min后用膠頭滴管吸去上層正己烷,下層液體過Agela Cleanert S C18固相萃取柱(預先依次用3 mL乙腈活化,3 mL水淋洗)進一步凈化。用5 mL的水淋洗并抽干,用4 mL乙腈以1滴·s-1的流量洗脫。洗脫液于45 ℃氮吹至干,用1 mL 20%乙腈溶液復溶,混勻后過0.22 μm針式水相尼龍濾膜,濾液收集至進樣小瓶中,按照儀器工作條件測定。
2.1 色譜行為
5 μg·L-1甲霜靈標準溶液及其10.0 μg·L-1內標溶液的選擇離子色譜圖見圖1。
圖1 選擇離子色譜圖
2.2 色譜條件的優化
2.2.1 色譜柱
甲霜靈具有一個芳香環的穩定結構,表現出一定的非極性特征。試驗選擇了一款針對芳香型化合物的Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm),以及一款通用型SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱(100 mm×2.0 mm,3.0 μm)進行比較。結果發現甲霜靈在兩款色譜柱中均能夠出峰,峰形良好且半峰寬均在0.25 min左右。為統一比較,后續優化試驗均使用SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱進行色譜分離。
2.2.2 流動相
乙腈和甲醇是比較常見的流動相,因此試驗將其作為流動相有機相。為了提高化合物離子化效率、改善峰形,通常在流動相水相中添加少量的揮發性酸,因此選擇水以及0.1%甲酸溶液分別作為流動相水相。試驗分別比較了水-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相體系時對甲霜靈的分離效果,根據不同流動相條件下甲霜靈的響應值來確定最佳流動相。
結果表明,甲霜靈在3種不同流動相中均能夠被洗脫且分離良好、峰形尖銳,但其在各流動相中的響應值不盡相同。如圖2所示:當使用0.1%甲酸溶液作為水相時,其提供的氫離子使0.1%甲酸溶液-甲醇體系和0.1%甲酸溶液-乙腈體系中的甲霜靈離子化效率提高;當使用乙腈作為有機相時,0.1%甲酸溶液-乙腈體系的色譜峰峰形較好且響應值較高。因此,試驗選擇0.1%甲酸溶液-乙腈體系作為甲霜靈的流動相。
圖2 不同流動相的分離效果
2.3 質譜條件的優化
將質量濃度為500 μg·L-1的甲霜靈和甲霜靈-d6的標準溶液通過蠕動泵分別注入質譜儀,確定母離子為m/z280.0和286.1,再通過二級質譜掃描,選擇穩定且豐度高的碎片離子作為定量離子,離子豐度次之者作為定性離子,對確定的母離子、子離子進行碰撞能量等參數的優化,具體質譜參數見表1。
2.4 樣品前處理方法的優化
2.4.1 提取劑
根據甲霜靈的化學性質,甲霜靈能溶于乙腈、水、甲醇等試劑,同時參考已有的文獻[6,11]中方法,試驗初步嘗試以0.1%(體積分數,下同)磷酸溶液、20%乙腈溶液、乙腈、甲醇、含1%(體積分數,下同)氨水的乙腈溶液(記作1%氨化乙腈)、含1%乙酸的乙腈溶液作為提取劑。使用峰面積的相對響應比值來比較不同提取劑對甲霜靈的提取效果(以含1%乙酸的乙腈溶液作為提取劑時甲霜靈響應值為100%計,其他試劑提取時的響應值與其比較)。
由于過固相萃取柱需要水溶液上樣,因此試驗首先嘗試使用水相占比較高的溶液作為提取劑。試驗發現:當使用0.1%磷酸溶液提取時,魚、蝦、蟹3種基質中均有大量水溶性蛋白雜質被提取出來,易堵塞固相萃取柱,進而導致試驗無法進行;使用20%乙腈溶液提取時,魚基質提取液澄清,而蝦、蟹類基質的提取液仍舊渾濁,難以過柱。因此考慮采用有機試劑(甲醇、乙腈、1%氨化乙腈和含1%乙酸的乙腈溶液)提取,以減少水溶性雜質的溶出。不同提取劑的提取效果見圖3。
圖3 不同提取劑的提取效果
結果表明:使用甲醇提取樣品時,發現上機檢測的色譜圖存在雜峰干擾;使用乙腈和1%氨化乙腈提取時發現存在基質干擾,目標物色譜峰的響應值低;而以含1%乙酸的乙腈溶液作為提取劑時,由于酸的存在沉淀了其他提取劑未能沉淀的部分蛋白,降低了基質的干擾,且氮吹時間短、目標物色譜峰前后無明顯雜峰、回收率高。綜合考慮,試驗選擇含1%乙酸的乙腈溶液作為提取劑。
2.4.2 溶解試劑
試驗采用含1%乙酸的乙腈溶液提取后,提取液中仍存在部分脂類、色素雜質以及少量蛋白。提取液濃縮后需要用合適的溶解試劑,在將目標物充分溶解出來的同時,盡量不溶解雜質,否則這些雜質的存在會使復溶后的溶液呈渾濁或黏稠狀態。試驗利用甲霜靈與雜質在溶液中溶解度不同的特性,比較了水和20%乙腈溶液作為溶解試劑時的效果差異。水對甲霜靈具有一定的溶解度,而脂類等雜質則基本不溶于水,可根據此特性復溶甲霜靈。但是結果發現,由于水無法將包裹在雜質中的少量甲霜靈溶解出來,回收率略低,比20%乙腈溶液的低25%左右,且回收率不穩定。而20%乙腈溶液保證了多數甲霜靈的溶解,降低了目標物的損失,且結果穩定。此外,該步驟還可將溶液狀態由純有機相改為了水相占比較多的狀態,滿足了其后過柱的需求。因此,試驗選擇20%乙腈溶液為溶解試劑。
2.4.3 正己烷體積
與植物源性基質不同,水產品基質樣品含有豐富的蛋白和脂類物質,這是造成基質干擾的主要原因。提取劑在提取目標物的同時,必定有一部分脂類及蛋白質等其他物質被同時提取出來,導致樣品測定時出現較多干擾,影響測定結果,因此須對樣品提取液進行凈化處理。正己烷是水產品藥物殘留檢測中常用的除脂試劑。試驗首先采用3 mL正己烷凈化,過柱氮吹后,魚和蝦類樣品的試管底部均無油脂殘留。由于蟹(性腺和肝胰腺)和貝類(肝胰腺)的可食部位中油脂含量過高,經3 mL正己烷凈化后仍有油脂殘留。因此,試驗將正己烷體積增大至7.5 mL,結果發現,使用7.5 mL正己烷時,蟹和貝類樣品在氮吹后試管中油脂量相對較少。因此,試驗選擇正己烷體積為7.5 mL。
2.4.4 固相萃取柱
僅用正己烷凈化,在上機后仍有明顯的雜質干擾目標物檢測,因此采用固相萃取法進一步凈化除雜,對固相萃取柱的類型進行優化。通過在正己烷去脂后的空白基質液中加入標準溶液過已活化的固相萃取柱來考察效果,對比了不同固相萃取柱Oasis HLB、Oasis PRiME HLB、Anavo HLB-P以及Agela Cleanert S C18的凈化效果以及對甲霜靈峰面積的影響,結果見表2。
表2 不同固相萃取柱的凈化效果
Oasis PRiME HLB、Anavo HLB-P是一類新型的固相萃取柱,無需進行柱活化和柱平衡步驟,操作簡便。但經二者凈化后,上機檢測時雜質峰較多且甲霜靈響應值低,分別為5.24×105和5.58×105,說明這兩種固相萃取柱對樣品組分有吸附作用,除雜能力較弱。Oasis HLB和Agela Cleanert S C18固相萃取柱使用前需要經過活化和平衡,二者凈化原理類似且均采用水溶液上樣,水淋洗,乙腈洗脫。上機檢測結果顯示:經Oasis HLB固相萃取柱凈化后的甲霜靈響應值較低,且過柱時間也較長;而Agela Cleanert S C18固相萃取柱富集凈化效果更好、速率較快、溶液澄清,甲霜靈色譜峰響應值高。因此,試驗選擇Agela Cleanert S C18固相萃取柱進行凈化。
2.5 基質效應
在加入內標后,通過乙腈純溶劑和基質溶液制作的標準曲線斜率之比,對化合物的基質效應狀況進行評價。其計算公式[16]如下:基質效應=(1-空白基質標準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率)×100%,一般基質效應在-15%～15%內說明基質效應不顯著[17]。結果顯示,鯽魚、羅氏沼蝦、中華絨螯蟹、河蚌等4種水產品基質效應分別為-1.55%,-5.18%,-7.15%,-10.24%,均在-15%～15%內,說明基質效應影響不顯著,通過乙腈制作標準曲線即可。
2.6 標準曲線、檢出限和測定下限
取適量的單標準溶液,用乙腈逐級稀釋,配制成甲霜靈質量濃度為1.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0 μg·L-1的標準溶液系列,內標甲霜靈-d6的質量濃度為10 μg·L-1。按照儀器工作條件測定,以甲霜靈的質量濃度為橫坐標,甲霜靈與甲霜靈-d6的峰面積之比為縱坐標,繪制標準曲線。結果顯示,甲霜靈標準曲線的線性范圍為1.0～100.0 μg·L-1,線性回歸方程為y=2.258×10-2x+1.352×10-2,相關系數為0.997 7。
空白樣品經處理后,測試其信噪比(S/N),分別確定檢出限和測定下限。以3倍信噪比得到目標物的檢出限(3S/N),結果為0.5 μg·kg-1;以10倍信噪比得到目標物的測定下限(10S/N),結果為1 μg·kg-1。
2.7 精密度和回收試驗
分別以鯽魚、羅氏沼蝦、中華絨螯蟹、河蚌空白樣品5.0 g為研究對象,進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平做6個平行樣,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。
表3 精密度和回收試驗結果(n=6)
由表3可知,甲霜靈的回收率為93.8%～105%,RSD均小于13%,其回收率和精密度均可滿足對水產品中甲霜靈的檢測要求。
2.8 樣品分析
按照試驗方法對從本實驗室常規檢測留存的不同批次樣品中隨機抽取鯽魚、羅氏沼蝦、中華絨螯蟹、河蚌等24個樣品及農貿市場購買的6個鯽魚樣品進行檢測,均未檢出目標物。
本工作通過對水產品中甲霜靈的樣品前處理方法和儀器工作條件進行研究,優化了不同提取劑、凈化方式、固相萃取條件以及色譜條件,提出了同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法測定多種水產品中甲霜靈殘留量的方法。該方法操作簡便、實用性強,可同時在魚、蝦、蟹、貝4類高脂肪、高蛋白的復雜基質中實現對甲霜靈殘留的定量檢測。同位素內標的加入也有效校正了前處理過程損失所帶來的偏差,提高了方法的準確度及穩定性,可實現大批量樣品的快速測定。
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