陳 飛, 韓 冰, 于廣峰, 鐘麗娟, 柴林山, 郭玲玲
(遼寧省微生物科學研究院,遼寧 朝陽 122000)
紅托竹蓀(Dictyophorarubrovolvata)屬真菌界擔子菌亞門(Basidiomycotina)腹菌綱(Gasteromycetes)鬼筆目(Phallales)鬼筆科(Phallaceae)竹蓀屬(Dictyophora),是一種名貴食藥兩用真菌。因其外形有一層獨特的形如傘狀的菌裙,有“雪裙仙子”之稱,被譽為菌中皇后。紅托竹蓀子實體和竹蓀蛋中富含大量的氨基酸、蛋白質、維生素等營養物質[1-2],具有抗氧化、抗糖化、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、抗疲勞和免疫調節等生物活性[3],口感清鮮脆嫩、風味獨特,營養豐富,受到廣大消費者的喜愛,有很高的經濟價值和藥用價值,自古就被列為“草八珍”之一[4-7]。隨著紅托竹蓀市場需求的擴大,提高產量和提升品質成為紅托竹蓀產業面臨的主要問題,而篩選高產優質的紅托竹蓀菌種是解決問題的有效方法[8-12]。本研究依據紅托竹蓀菌種生長過程營養需求,制備紅托竹蓀菌種快速分離培養基,并通過響應面法進行培養基優化,優化的紅托竹蓀菌種快速分離培養基不僅可以提高紅托竹蓀組織分離菌種生長速度,縮短時間、提高菌種分離效率,還可以滿足紅托竹蓀菌種對淀粉、木質素、纖維素等營養需求,強壯紅托竹蓀菌絲,可根據培養菌絲過程中形成的透明圈大小判定菌種胞外酶產生能力,達到快速評價菌種質量的目的。
1.1 材料
1.1.1 菌種 菌種由紅托竹蓀(Dictyophorarubrovolvata)竹蛋組織分離獲得,竹蛋采自遼寧蘑磨達食用菌科技有限公司工廠化栽培基地。
1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯(去皮) 200.0 g,放入蒸餾水1 000 mL煮沸20 min,過濾,取濾液,蒸餾水補足1 000 mL,加入葡萄糖 20.0 g,瓊脂 18.0 g,pH值自然;快速分離培養基：取大小為(0.3～0.5) cm ×(0.3～0.5) cm的1 kg木屑加入10 L蒸餾水,煮沸30 min,過濾得木屑水,將200 g土豆切片置于木屑水中,煮沸20～30 min,取濾液用蒸餾水按照實驗要求補足用量;按試驗設計,稱取不同量的葡萄糖、全麥粉、玉米粉添加入培養基中,文火將18%瓊脂粉融化后裝入500 mL三角瓶中,裝量為300 mL/瓶,121 ℃滅菌20 min,冷卻至35 ℃,分裝一次性培養皿(直徑9 cm),冷卻備用。菌種木屑培養料：將制備木屑水后收集的木屑按照粗木屑70%、細木屑15%、玉米粉10%、全麥粉5%配比(質量分數),含水量60%～65%配制紅托竹蓀木屑菌種培養料,將培養料裝入500 mL玻璃菌種瓶中,裝料至瓶口2～3 cm,用帶有透氣口的塑料瓶蓋封口,121 ℃滅菌120 min,冷卻后備用。
1.1.3 主要試劑與儀器設備 葡萄糖(分析純,沈陽新興試劑廠);瓊脂(北京奧博星生物技術有限責任公司);木屑、全麥粉、玉米粉等購自遼寧蘑蘑達食用菌科技有限公司。生物安全柜(HFsafe1200,上海力申科學儀器有限公司);顯微鏡(Nikon EcLIPSE Ci,上海通灝光電科技有限公司);自動菌落計數分析儀(Shineso,杭州迅數科技有限公司);冰箱(BCD-649WADV,青島海爾股份有限公司);立式高壓蒸汽滅菌器(LDZX-75KBS,上海申安醫療器械廠);電熱鼓風干燥箱(DHG-9240A,上海一恒科學儀器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 紅托竹蓀菌種分離 無菌條件下,用滅菌器具取(0.4～0.6) cm×(0.4～0.6) cm竹蛋內白色組織接種至紅托竹蓀菌種木屑培養基中,25 ℃培養30 d,取木屑菌種做為紅托竹蓀菌種快速分離培養基配方優化菌種[12-13]。
1.2.2 紅托竹蓀菌種快速分離培養基優化 選擇葡萄糖(A)、全麥粉(B)、玉米粉(C)、木屑水(D)4個因素進行考察,每個因素取上限(+1)、下限(-1)2個水平,試驗因素與水平設計見表1。以紅托竹蓀菌種菌絲生長速度為響應值,通過Design-Expert 8.0.6軟件設計四因素三水平顯著影響因素的Box-Behnken響應面試驗[16-19],測定菌絲生長速度,對紅托竹蓀菌絲生長速度(mm/d)進行二次多元回歸方程擬合,得到各因素與響應值之間函數關系的回歸方程,根據生成響應面圖確定最優的培養基配方(表2)。
表1 試驗因素與水平設計
表2 Box-Benhnken 實驗設計及結果
1.2.3 快速分離培養基驗證試驗 將按照Design-Expert 8.0.6響應面優化的紅托竹蓀菌種快速分離培養基與PDA培養基對比并進行木屑培養基培養試驗,驗證該方程擬合度。①快速分離培養基與PDA培養基對比試驗：取1.2.1中紅托竹蓀木屑菌種塊(0.3×0.3) cm ～ (0.5×0.5) cm,接種于PDA培養基、菌種快速分離優化培養基中,每皿培養基接種3個木屑菌種塊,3個接種點呈等邊三角形,接種點距離培養皿邊緣0.8～1.0 cm,每種培養基3次重復,25 ℃恒溫培養36
d[20],利用Shineso MF5&MF6數據分析平臺,采用十字交叉方法測定菌落直徑,按照菌絲生長速率(mm/d)=菌落平均直徑(mm)/培養時間(d),計算不同培養基菌絲生長速度;在Nikon EcLIPSE Ci 顯微鏡20倍目鏡40倍物鏡條件下,利用NIS-Elements D數據平臺觀察菌絲狀態及鎖狀聯合,并用測微尺測定菌絲直徑;在Shineso自動菌落計數分析儀白色底光下,觀察菌落形態。②木屑培養基培養試驗：取1.2.3①中同一個培養皿3個接種點接種到同一瓶木屑培養基中,利用劃線法測定PDA培養基、快速分離培養基培養的菌絲在木屑培養基25 ℃恒溫培養10 d的生長速度。木屑培養基菌絲生長速度(mm/d)=菌絲長度(mm)/培養時間(d)。
2.1 紅托竹蓀菌種快速分離培養基優化
2.1.1 模型建立及顯著性分析 以紅托竹蓀菌絲生長的菌落直徑為響應值,運用Box-Benhnken設計29 組試驗。Box-Benhnken 試驗設計及結果見表2。
用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的結果進行多元回歸擬合,得到回歸方程：Y=24.56+0.64A+0.82B+0.34C+0.90D+0.30AB+0.55AC-0.088AD-0.42BC+0.38BD-0.13CD-1.07A2-1.26B2-1.48C2-0.79D2。
該模型的決定系數R2=0.970 2,校正決定系數 AdjR2=0.940 3,說明實際值和預測值擬合度比較好。由表3可以看出,該回歸模型P<0.000 1,表明此二次模型極顯著,失擬項的P=0.383 1>0.05,模型失擬項不顯著,說明無失擬因素存在,表明該模型在統計學上有意義。模型中 A、B、D、A2、B2、C2、D2的P<0.01,表明這些項對紅托竹蓀菌絲生長速度影響極顯著。C的P<0.05,表明對紅托竹蓀菌絲生長速度的影響顯著。
表3 Box-Benhnken 試驗方差分析
從對紅托竹蓀菌絲生長速度影響分析看,一次項A、B、D均達到極顯著水平,C達到顯著水平影響,影響順序為D(木屑水)>B(全麥粉)>A(葡萄糖)>C(玉米粉)。最后得到的優化培養基配方：葡萄糖20.71 g/L,全麥粉8.36 g/L,玉米粉8.07 g/L,瓊脂粉18.00 g/L,木屑水1.06 L,預見25 ℃恒溫培養,最大生長速度為0.62 mm/d。
2.1.2 響應面交互作用分析 通過Design-Expert 8.0.6軟件,得到兩因素交互作用的3D響應面曲線(圖1)?？梢钥闯鰞梢蛩刂g的交互作用時,其中一個因素固定,隨著另一個因素的增加,紅托竹蓀菌絲生長速度均呈現先增加后降低的趨勢。曲面傾斜度越大,越接近曲面頂端顏色愈深,表示作用越明顯,說明相關兩因素交互作用顯著,曲面的變化相對平緩,說明相關兩因素交互作用不明顯。
圖1 快速分離培養基條件下的 3D 響應面圖Fig.1 3D response surface curve under optimal fermentationconditionsA：A～B因素交互響應曲面;B：A～C因素交互響應曲面;C：
A～D因素交互響應曲面;D：B～C因素交互響應曲面;E：B～D因素交互響應曲面;F：
C～D因素交互響應曲面A：Response surface stereogram for factors of A and B; B：Response surface stereogram for factors of A and C;C：Response surface stereogram for factors of A and D; D：Response surface stereogram for factors of B and C;E：Response surface stereogram for factors of B and D; F：Response surface stereogram for factors of C and D
2.2 快速分離培養基驗證試驗
2.2.1 PDA培養基、快速分離培養基鎖狀聯合觀察及菌絲狀態(菌絲直徑)測定 在Nikon EcLIPSE Ci 顯微鏡20倍目鏡40倍物鏡條件下，利用NIS-Elements D數據平臺觀察菌絲狀態及鎖狀聯合，并用測微尺測定菌絲直徑(圖2、圖3和表4)。圖2和圖3中“O”標記分別為顯微觀察菌絲鎖狀聯合和菌絲直徑測定結果。兩種培養基培養的菌絲均可形成鎖狀聯合；
通過測微尺測定菌絲直徑，快速分離培養基培養的菌絲直徑均大于PDA固體培養基，菌絲平均直徑增加66.25%。
圖2 PDA培養基與快速分離培養基鎖狀聯合顯微觀察結果Fig.2 Combined microscopic observation of PDA medium and rapid culture separation mediumA：PDA培養基; B：菌種快速分離培養基A：PDA medium; B：Rapid culture separation medium
圖3 PDA培養基與菌種快速分離培養基顯微菌絲狀態對比圖
表4 PDA培養基與快速分離培養基的菌絲直徑顯微測定
2.2.2 PDA培養基、快速分離培養基菌絲生長速度測定 利用Shineso MF5&MF6數據分析平臺,采用十字交叉方法測定菌落直徑,按照菌絲生長速率=菌落平均直徑(mm)/培養時間(d),25 ℃恒溫培養36 d[20],計算不同培養基菌絲生長速度(表5)。根據菌絲生長速率=菌落平均直徑(mm)/培養時間(d)計算PDA培養基與菌種快速分離培養基菌絲生長速度,PDA培養基0.45 mm/d,快速分離培養基0.6 mm/d,快速分離培養基菌絲生長速率提高33.33%。
表5 PDA培養基與菌種快速分離培養基平皿培養生長速度
2.2.3 PDA培養基、快速分離培養基培養菌落形態觀察結果 在Shineso自動菌落計數分析儀白色底光下,觀察菌落形態(圖4),PDA培養基無透明圈形成,而快速分離培養基可以形成透明圈。
圖4 PDA培養基與菌種快速分離培養基菌落形態(A)及透明圈(B)觀察Fig.4 Observation of colony transparent circle in PDA medium and rapid isolation medium
2.2.4 木屑培養基菌絲生長速度測定結果 利用劃線法測定PDA培養基、快速分離培養基培養的菌絲在木屑培養基中25 ℃恒溫培養10 d的生長速度,分別為1.47 mm/d和2.12 mm/d(表6),快速分離培養基培養菌絲在木屑培養基中生長速度相比PDA培養基培養菌絲生長速度平均提高44.22%。
表6 兩種培養基培養的菌絲在木屑培養基中培養10 d的生長速度Table 6 The growth rate of mycelia of 2 medium cultured in wood chips medium for 10 days
食用菌菌絲生長不僅取決于菌種本身特性,還需要合適的培養條件,適合的培養基是提高菌種選育效率,提高菌種質量的基礎[21]。紅托竹蓀與其他食用菌種類相比,生長較慢,生長周期長,原因可能是因為菌絲轉接后,需要一定時間適應新的生長環境,即生長恢復期;適應新的環境后,營養物質豐富,菌絲快速生長,即生長旺盛期;待旺盛期后,營養物質減少,代謝產物的積累等導致菌絲活力減弱、生長速度逐漸下降[22]。
紅托竹蓀是木腐食用真菌,通過分解木質素等為自身的生長提供碳源、氮源[23]。為滿足菌絲生長過程所需營養物質,使分離純化菌絲快速適應生長環境,本研究將PDA固體培養基配制用水改為木屑水,同時在培養基內添加合適比例的全麥粉和玉米粉[24-25],培養基中含有的淀粉、纖維素、木質素等成分,在紅托竹蓀菌種生長過程中可刺激菌種分泌淀粉酶、纖維素酶、木質素酶等胞外酶,以維持胞外淀粉酶系、木質素酶系、纖維素酶系完整性[26-28],促進菌絲體旺盛生長,提高分離效率。本研究以菌絲生長速度、菌絲直徑等為主要評價指標,通過響應面優化確定快速分離培養基最佳配方為葡萄糖20.71 g/L、全麥粉8.36 g/L、玉米粉8.07 g/L、瓊脂粉18.00 g/L、木屑水1.06 L。優化的快速分離培養基菌絲直徑平均增加66.25%,平皿培養菌絲日平均生長速度增加33.33%。將優化的快速分離培養基培養的紅托竹蓀菌種和PDA培養的紅托竹蓀菌種分別轉接至相同配方的木屑培養基中,菌絲在木屑培養基中的生長速度明顯提高,日平均生長速度增加44.22%,縮短了菌種生產周期,為提高紅托竹蓀菌種分離篩選效率奠定基礎。另外,由于在培養基中形成透明圈[29-31],可根據透明圈大小判定菌種胞外酶產生能力,達到快速評價菌種質量,保障菌種質量的目的。
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