摘要：以蕓薹屬植物青海大黃油菜（Brassica rape）和黑芥（Brassica nigra）為研究對象，對其常規雜交后，通過離體胚培養獲得的雜種種子經MS培養基誘導培養成苗，獲得了青海大黃油菜與黑芥的雜種F1代植株，形態上表現為中間類型。通過細胞學的方法，鑒定了雜種F1代植株的細胞染色體數為18條，為母本青海大黃油菜（2n=AA=20）和父本黑芥（2n=BB=16）的配子染色體數之和；SSR分子鑒定進一步表明，該雜種植株為真雜種。
關鍵詞：青海大黃油菜（Brassica rape）；黑芥（Brassica nigra）；種間雜交；胚培養；芥菜型油菜
中圖分類號：X565.4；S334.3文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）08－1746-04
New Brassica juncea Sythesized from Interspecific Hybridization Between B. rapa（Qinghai dahuang） and B. nigra
ZHAO Zhi-Gang
（Academy of Agriculture and Forestry， Qinghai University/National Key Laboratory Breeding Base for Innovation and Utilization of Plateau Crop Germplasm/Key Laboratory of Spring Rape Genetic Improvemen of Qinghai Province， Xining 810016， China）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｎｅｗ Ｂｒａｓｓｉｃ ｊｕｎｃｅａ ｃａｎ ｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ． ｒａｐａ ａｎｄ Ｂ． ｎｉｇｒａ ． Ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｂ． ｒａｐａ×Ｂ． ｎｉｇｒａ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏ ｓｈｏｏｔ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｈａｄ ａｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｏｆ Ｆ１ ｐｌａｎｔｓ ｈａｄ １８ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｓｕｍ ｏｆ ｇａｍｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ｐａｒｅｎｔ Ｂ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（２ｎ＝ＡＡ＝２０） ａｎｄ ｍａｌｅ ｐａｒｅｎｔ Ｂ． ｎｉｇｒａ（２ｎ＝ＢＢ＝１６）． ＳＳＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒｕｅ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ． ｒａｐａ（Ｑｉｎｇｈａｉ ｄａｈｕａｎｇ）ａｎｄ Ｂ． ｎｉｇｒａ． Ｔｈｅ rｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｎｏｖａｔｉｎｇｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉａｃ ｊｕｎｃｅａ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｑｉｎｇｈａｉ Ｄａｈｕａｎｇ ｒａｐｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐｅ）； Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ； ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄ； ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ
蕓薹屬植物由白菜（Brassica pekinensis， 2n=AA=20）、甘藍（B. oleracea，2n=CC=18）、黑芥（B. nigra， 2n=BB=16）3個基本種和甘藍型油菜（B. napus，2n=AACC=38）、埃塞俄比亞芥（B. carinata，2n=BBCC=34）、芥菜型油菜（B. juncea，2n=AABB=36）3個復合種組成，是一個遺傳類型極其豐富、變異極其廣泛的基因庫，這為蕓薹屬植物的種間雜交或與近緣屬的屬間雜交以及培育或創造作物新品種、新類型提供了豐富的物質基礎及遺傳背景。近年來，人們對屬內各個種進行了遺傳、育種、栽培等方面的研究，為各個種的綜合利用奠定了堅實的基礎。同時，進行了大量的種間雜交、屬間雜交，探討了種屬間關系，創造出大量的遺傳育種新材料，推動了油菜遺傳育種的研究。李再云等［1，2］、徐利遠等［3］研究了甘藍型油菜與諸葛菜、藍花子間的遠緣雜交，以及諸葛菜、藍花子與蕓薹屬的親緣關系和雜種后代的細胞學行為。文雁成等［4］、張國慶等［5］利用甘藍與白菜雜交，進行了人工合成甘藍型油菜的研究，拓寬了甘藍型油菜的遺傳基礎。Chen等［6］利用甘藍型油菜和白菜型油菜品種，Poulsen等［7］利用埃塞俄比亞芥和甘藍型油菜品種，Meng等［8］利用白菜和埃塞俄比亞芥與甘藍型油菜品種進行種間遠緣雜交，將不同優良性狀導入到甘藍型油菜中，創造了大量遺傳育種的中間材料。
青海大黃油菜是青海農家白菜型油菜品種，近年來育種工作者在育種實踐中發現大黃油菜粒大、種皮鮮黃、能自交結實，表現出一系列的優良性狀，但國內外目前還未對該品種資源的優良特性進行較系統的研究，也鮮見將該資源應用于油菜育種中。因此，利用青海大黃油菜與黑芥種間有性雜交，將青海大黃油菜的優良性狀轉入到芥菜型油菜中，再以新型的芥菜型油菜去轉育現有的芥菜型油菜品系，可以獲得自然界沒有的芥菜型油菜新資源。然而，不同種、屬或親緣關系更遠的個體間的遠緣雜交存在雜交不親和性和雜種后代生活力弱等缺點。在十字花科植物中， 青海大黃油菜和黑芥屬于不同種的植物， 二者存在嚴重的雜交不親和性，胚挽救和子房培養等技術能夠用來克服雜交不親和性， 提高雜交效率。因此，本試驗通過青海大黃油菜與黑芥的雜交，適時摘取正在發育的胚進行離體培養，獲得了青海大黃油菜與黑芥的雜交F1代幼苗，并對幼苗進行了形態學、細胞學和分子標記的鑒定。
1材料與方法
1.1試驗材料
試驗材料為青海大黃油菜和黑芥。上述材料均由青海省農林科學院春油菜研究所提供，并于2012年4月種植于青海大學農林科學院四號試驗基地。
1.2方法
1.2.1種間有性雜交2012年6月，選取生長健壯的青海大黃油菜為母本，摘除已開花的花蕾和過小的花蕾，對尚需2~3 d后才能開花的花蕾進行剝蕾去雄，授以黑芥的新鮮花粉，每次授粉完成后立即套袋。
1.2.2胚搶救、快繁及染色體加倍試驗以青海大黃油菜×黑芥組合為研究對象，從雜交后10 d開始解剖、觀察胚的發育情況以確定最適培養時間。雜交后18~22 d，將取回的子房先用70%的乙醇處理2 min，再用0.1%的氯化汞消毒處理15 min后，用無菌水洗3次，每次5 min，在超凈工作臺上，用消毒的鑷子在無菌濾紙上小心將幼胚剝出，放在含有3%蔗糖的MS固體培養基上培養，在25 ℃的光照培養室培養直到分化成苗，成苗后將無菌苗轉到含有0.25 mg/L NAA（a-萘乙酸）、1.5 mg/L 6-BA（6-芐氨基嘌呤）的MS固體培養基上進行快速繁殖。15~20 d后，幼苗轉入含0.1 mg/L NAA的MS生根培養基進行生根培養。將幼苗移栽溫室30 d后，再將部分苗子挖出，用100 mg/L的秋水仙素溶液浸泡幼苗的根部3~4 h，后用清水連續沖洗5~6次，再次栽于溫室中。試驗中所用各培養基成分具體見表1。
1.2.3真假雜種鑒定試驗
1）F1代植株形態學觀察。2013年3~5月，觀察、記載F1代雜種植株生長發育不同階段的形態變化，并照相。
2）普通細胞學鑒定。用0.002 mol/L的8-羥基喹啉處理F1植株幼小花蕾中的子房，3 h后用卡諾固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定24 h后，室溫保存。取固定好的子房用1 mol/L的HCI在60 ℃恒溫水浴鍋中水解5~8 min，用10%改良卡寶品紅染色并壓片，在顯微鏡下觀察并記錄染色體數目。
3）雜種后代的分子鑒定。采用CTAB小樣法提取油菜基因組DNA，利用SSR標記進行真假雜種鑒定，其PCR反應體系為：10×buffer（含Mg2+）1.00 μL，10 mmol/L dNTPs 0.80 μL，5U Taq酶0.15 μL，50 ng/μL引物各0.25 μL，50 ng/μL DNA 1.00 μL，ddH2O 6.55 μL。其中Taq酶和dNTPs均購自大連寶生物有限公司， SSR引物由上海生工合成，本研究所用引物名稱及序列見表2。
2結果與分析
2.1遠緣雜種的獲得
2011年以青海大黃油菜為母本、黑芥為父本進行雜交授粉，授粉后30 d左右取回莢果，剝離胚珠，發現大多數胚在發育過程中夭亡，莢果內只剩下種皮，沒有獲得遠緣雜交的種子。2012年從授粉后10 d開始解剖觀察胚的發育情況，以此確定最適胚搶救時間。結果表明，授粉26 d后部分胚珠珠被開始皺縮變白，在以后的幾天里胚珠逐漸變褐發黑，胚乳已經敗育，胚珠逐漸死亡，統計結果見表3。綜合以上調查結果，對所有雜交組合在雜交授粉后22 d取材進行胚培養是最適培養時間。
2.2雜種形態學觀察與性狀分析
雜種苗分為2批種植于溫室，其中一批經過秋水仙素進行染色體加倍，一批未加倍。未經過加倍的雜種苗生長旺盛，葉子的顏色和形狀介于青海大黃油菜與黑芥之間，葉面上生有小刺毛，特別是葉子邊緣上的剛毛比較明顯，這一點與父本黑芥相同，葉邊緣鋸齒狀較淺，介于父本和母本之間（圖1）。從成熟植株的形態看， 雜種植株分枝較多， 分枝部位較低。在現蕾期和開花期，雜種植株的花藥全部退化。
2.3染色體加倍效果
用秋水仙素處理20株雜種幼苗根部以進行染色體加倍，結果顯示秋水仙素對其有明顯的毒害作用，部分植株莖尖縮短，部分植株基部潰爛、死亡，只有9株能正常生長，開始長勢良好，但1個月后，9株正常生長的幼苗依次從基部的葉片開始變黃，直至全部死亡。本研究沒有獲得染色體加倍成功的人工芥菜型油菜，在沒有進行加倍處理的植株中也未發現自然加倍植株。
2.4雜種后代的細胞學鑒定結果
青海大黃油菜的體細胞染色體數為20條，父本黑芥的體細胞染色體數為16條。對雜交后胚培養獲得的F1代幼小子房進行了體細胞觀察，發現雜種體細胞具有18條染色體（圖2），為青海大黃油菜（n=10）和黑芥（n=8）配子染色體數目之和， 在細胞學水平上進一步說明了F1代植株是真雜種。
2.5雜種后代的SSR分子標記鑒定結果
取親本和F1植株的幼嫩葉片提取DNA，進行SSR分子標記鑒定，10對引物中引物SSR549和SSR646在親本青海大黃油菜和黑芥中分別檢測到特異性條帶，因此這兩對引物可用于種間雜種F1植株的鑒定。對所獲得的7株F1雜種植株SSR分子標記鑒定結果表明，由青海大黃油菜與黑芥雜交得到的F1雜種植株同時具有父、母本的特征帶（圖3），為真雜種。
3討論
3.1子房培養與胚培養的有效性
由于青海大黃油菜和黑芥的種間雜交不親和性，大田條件下很難收獲到它們的種間雜種。在本次試驗中，所有的正交組合（青海大黃油菜×黑芥）和反交組合中（黑芥×青海大黃油菜）都通過胚搶救來獲得雜種，但是，僅在正交組合中獲得了雜種，反交組合均未成功獲得雜種。Watkins［9］認為不同染色體數目的種間雜交時采用染色體數目高的作母本較易成功。Müntzing［10］也曾提出一個假說， 種子各部分的染色體數必須是母本組織∶胚乳∶胚=2∶3∶2，如果這一比例因倍數不同的種間雜交而擾亂就會發生敗育情形，本研究的結果與這些假設基本一致。同時，Inomata［11］的研究表明，子房培養能大大提高白菜×甘藍組合的雜種獲得率，而對于反交組合甘藍×白菜卻沒有效果，而Takeshita等［12］在甘藍和白菜雜交組合中的研究表明，胚搶救技術更適用于以甘藍為母本的雜交組合，考慮到以上情況，作者認為在反交組合中應該先利用子房培養，再進行胚培養，能否獲得反交的雜種幼苗有待進一步研究。
3.2胚培養的最適時間
本研究結果表明，在以青海大黃油菜為母本的組合中，雜交授粉后22 d取材進行胚培養最易成功。由于各個組合胚胎敗育發生的時間不同，最適取材時間也就不同，因此胚搶救的最佳取材時期也許會因雜交組合的不同而不同，授粉后，過早或過遲取胚離體培養都不利于獲得雜種苗。這可能是因為胚在早期發育比較小，不易從種子中分離以及胚的早期發育對營養條件要求很嚴格，簡單的培養基無法滿足其要求，因而離體培養難以成功；而授粉后時間過于延長，雜種核與細胞質的代謝或雜種胚胎與胚乳的發育不協調性增強，導致雜種胚凋亡，無法挽救，因此，適時將雜種胚進行離體培養，提供適宜的營養環境及發育的外界環境，可能有利于降低代謝的不協調性，提高胚培養成功率［13］。
3.3染色體加倍效果
染色體加倍對遠緣雜種的保存和利用具有較重要的意義。在本試驗中通過秋水仙素處理并未獲得染色體加倍的植株。在前人人工合成甘藍型油菜的研究中，也發現個別組合雜種難以加倍，比如DB（白菜型油菜）×T4（羽衣甘藍）的雜種，即使后來在現蕾期用0.5%的秋水仙素溶液浸根4 h也沒有加倍成功［14］。本次試驗中加倍處理時間不足，加之秋水仙素有一定的毒害作用，導致幼苗沒有加倍或加倍后被毒害死亡，原因和加倍方法的改進有待進一步研究。在沒有進行加倍處理的植株中也未發現自然加倍植株，說明人工芥菜型油菜的加倍效率較低。
3.4芥菜型油菜人工合成種應用前景
青海大黃油菜屬白菜型油菜地方品種，子粒鮮黃、千粒重高（6.6 g）、含油量高（41.09%）、自交親和性強（親和指數為11.85）、皮殼率低（12.8%）、粒色性狀遺傳穩定，是一個優良的黃子種質資源［15］。本試驗從形態學和細胞學對雜種進行了真假雜種鑒定，同時采用了SSR分子標記法進一步證明了該雜種是真雜種，為進一步將青海大黃油菜的優良性狀轉入芥菜型油菜中奠定了基礎，達到拓寬芥菜型油菜種質資源的目的。
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