楊碩 ，徐中利 ，趙新芝 ，石典花 ，4，戴衍朋 ，4，畢鈺 ，辛義周 （.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 5004；
.山東省平邑縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 平邑 700；
.山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 5004；
4.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥蜜制和制炭炮制技術(shù)與原理重點(diǎn)研究室，濟(jì)南 5004；
5.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，濟(jì)南 5004）
大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖[1]，主要含蒽醌類、蒽酮類、茋類、鞣質(zhì)類、苯丁酮類等成分，具有瀉下、抗炎、保肝、利尿、抗腫瘤等藥理作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，唐古特大黃、掌葉大黃、藥用大黃中各類成分含量存在差異，唐古特大黃中蒽酮、鞣質(zhì)及黃烷醇類成分含量均高于藥用大黃及掌葉大黃，掌葉大黃的游離蒽醌類成分含量普遍高于唐古特大黃及藥用大黃，提示不同基原大黃飲片的主治功能可能不同[3]。2020年版《中國(guó)藥典》（一部）收載的含大黃及其炮制品的中成藥制劑有100多種，不同基原大黃飲片對(duì)中醫(yī)臨床、中成藥組方及其療效均有一定影響，因此有效辨識(shí)大黃基原對(duì)指導(dǎo)大黃臨床精準(zhǔn)應(yīng)用具有重要意義。
目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)大黃基原鑒定的主要方法包括原植物外觀鑒定[4]、性狀鑒定[5]、高效液相色譜指紋圖譜鑒定[6]、分子生物學(xué)鑒定[7]等。其中，性狀和顯微鑒定對(duì)大黃植物或藥材特征完整性要求較高，需依靠長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)積累才能進(jìn)行有效鑒別，而經(jīng)過深加工的大黃飲片及中成藥，形態(tài)特征被破壞使得鑒定難度明顯增加。有研究證明，葉綠體基因間隔區(qū)rps16-trnQ、psaA-ycf3等均可作為特異DNA條形碼用于大黃基原的鑒定[8]，但此法操作及分析復(fù)雜。
近年來隨著電子舌、電子鼻等電子感官系統(tǒng)以及氣相-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）的應(yīng)用，對(duì)藥品滋味及氣味的評(píng)判逐漸準(zhǔn)確化[9]。研究報(bào)道顯示，電子鼻技術(shù)已被用于不同基原郁金飲片氣味特征的分析與鑒別[10]，電子舌技術(shù)已被用于川牛膝滋味的分析與鑒別[11]，GC-IMS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可證明當(dāng)歸酒洗品、酒浸品、酒炙品中的揮發(fā)性成分存在差異[12]。基于此，本研究采用電子感官系統(tǒng)和GC-IMS技術(shù)分析不同基原大黃飲片滋味、氣味以及揮發(fā)性有機(jī)物差異，建立快速辨識(shí)大黃飲片基原的方法，為大黃飲片基原辨識(shí)和質(zhì)量控制提供新方法和思路。
1.1 主要儀器
本研究所用的主要儀器包括SA-402B型電子舌（日本Insent公司）、PEN3型電子鼻（德國(guó)Airsense公司）、FlavourSpec?型風(fēng)味分析儀（德國(guó)G.A.S.公司）、XS205 10－5DU型電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]、KQ-200VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、FW-80型高速萬能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）等。
1.2 主要藥品與試劑
大黃飲片共8批（所選的樣本均是大黃主產(chǎn)地甘肅、湖北的代表性樣本[13]），經(jīng)濟(jì)南市中藥協(xié)會(huì)宋希貴主任藥師鑒定分別為蓼科植物掌葉大黃R.palmatumL.、唐古特大黃R.tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃R.officinaleBaill.的干燥根和根莖。3種基原大黃飲片的樣品信息見表1。
表1 樣品信息
2.1 電子舌技術(shù)測(cè)定大黃飲片滋味信息
將大黃飲片粉碎過四號(hào)篩，精密稱取大黃飲片粉末4 g，精密加入去離子水100 mL，超聲（功率100 W，頻率45 kHz）提取30 min，取上清液，作為待測(cè)樣品溶液。將電子舌傳感器（AAE、CT0、CA0、C00、AE1）與參比電極分別于基準(zhǔn)液（30 mmol/L氯化鉀+0.3 mmol/L酒石酸）和3.33 mol/L氯化鉀溶液中活化24 h后安裝，用參比溶液校正，于室溫25 ℃下測(cè)定樣品鮮味、咸味、酸味、苦味、澀味以及豐富度。傳感器C00和AE1經(jīng)參比溶液簡(jiǎn)單清洗，測(cè)定殘留的滋味（即苦味回味和澀味回味）。數(shù)據(jù)采集時(shí)間30 s，采集4個(gè)周期，第1個(gè)周期數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，為了提高數(shù)據(jù)精度，數(shù)據(jù)分析時(shí)刪除第1個(gè)周期數(shù)據(jù)，使用第2～4個(gè)周期的測(cè)量數(shù)據(jù)。利用電子舌自帶分析軟件Taste analysis application作雷達(dá)圖對(duì)比分析；
使用Origin 2021軟件作傳感器響應(yīng)值柱狀圖分析并建立判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA）鑒別模型；
使用SIMCA軟件建立主成分分析（principal component analysis，PCA）鑒別模型；
使用SPSS軟件建立Fisher判別模型。
2.2 電子鼻技術(shù)測(cè)定大黃飲片氣味信息
將大黃飲片粉碎過四號(hào)篩，精密稱取大黃飲片粉末5 g于分析小瓶中，密封后在80 ℃水浴中孵育15 min，再將進(jìn)樣針頭插入分析小瓶中進(jìn)行氣味數(shù)據(jù)采集。測(cè)定條件為：傳感器自清洗時(shí)間60 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，分析時(shí)間120 s，進(jìn)樣流量400 mL/min。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。利用電子鼻系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行Loading分析；
使用Origin 2021作顏色映射瀑布圖分析；
使用SIMCA軟件作偏最小二乘法判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），并進(jìn)行變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）分析。
2.3 GC-IMS技術(shù)檢測(cè)大黃飲片中揮發(fā)性有機(jī)物信息
將大黃飲片粉碎過四號(hào)篩，精密稱取粉末1.0 g，置于20 mL頂空瓶中，80 ℃水浴孵育15 min后進(jìn)樣測(cè)定。采用FlavourSpec?型風(fēng)味分析儀進(jìn)行分析，根據(jù)前期中藥測(cè)定的常規(guī)經(jīng)驗(yàn)參數(shù)及優(yōu)選結(jié)果確定檢測(cè)條件。IMS檢測(cè)條件如下：溫度45 ℃，漂移管長(zhǎng)度5 cm，管內(nèi)線性電壓400 V/cm；
漂移氣為N2（純度≥99.999%），流速150 mL/min。GC檢測(cè)條件如下：色譜柱為MXT-WAX柱（30 m×0.53 mm，1.0 μm），分析時(shí)間30 min，柱溫60 ℃；
載氣為N2（純度≥99.999%），流速2 mL/min（0～2 min）、2～10 mL/min（2～5 min）、10～100 mL/min（5～25 min）、100 mL/min（25～30 min）。進(jìn)樣條件如下：進(jìn)樣體積100 μL；
進(jìn)樣針溫度85 ℃；
孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。通過儀器配套分析軟件Vocal及其插件，分別作二維俯視圖和指紋圖譜；
使用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA、PLS-DA分析。
3.1 電子舌滋味測(cè)定結(jié)果
由于TGT1樣品各滋味值和豐富度均較高，故本研究以TGT1為參比得到其余樣品味覺值，正值表示滋味值比TGT1強(qiáng)，負(fù)值表示滋味值比TGT1弱。由雷達(dá)圖和柱狀圖（圖1A、圖1B）可見，唐古特大黃的澀味（astringency）及澀的回味（aftertaste-A）最強(qiáng)，掌葉大黃次之，藥用大黃最弱；
掌葉大黃的苦味（bitterness）及苦的回味（aftertaste-B）最強(qiáng)，藥用大黃次之，唐古特大黃最弱。由PCA、DFA圖（圖1C、圖1D）可見，藥用大黃、掌葉大黃和唐古特大黃各自聚集在一起，說明不同基原大黃飲片間滋味差異大，同基原間相似度較高，可較好區(qū)分不同基原大黃飲片。
圖1 電子舌滋味檢測(cè)數(shù)據(jù)分析結(jié)果
根據(jù)3種基原大黃飲片的滋味數(shù)據(jù)，利用SPSS軟件建立Fisher判別模型[14]，觀察值X1為酸味值、X2為苦味值、X3為澀味值、X4為苦味回味值、X5為澀味回味值、X6為鮮味值、X7為豐富度、X8為咸味值，Y1、Y2表示判別函數(shù)值。建立的判別函數(shù)為Y1=52.671+2.452X1+0.06X2+0.411X3－1.135X4+2.460X5－4.317X6+5.667X7－3.644X8、Y2＝－57.078+1.403X1+1.788X2+0.272X3－2.50X4+1.087X5+9.608X6－9.516X7+1.144X8。其中，唐古特大黃飲片檢測(cè)數(shù)據(jù)代入后判別函數(shù)值Y1＞0、Y2＞0，藥用大黃飲片檢測(cè)數(shù)據(jù)代入后判別函數(shù)值Y1＜0、Y2＜0，掌葉大黃飲片檢測(cè)數(shù)據(jù)代入后判別函數(shù)值Y1＜0、Y2＞0。因此，可通過根據(jù)電子舌檢測(cè)數(shù)據(jù)建立的Fisher判別模型對(duì)大黃飲片基原進(jìn)行快速辨識(shí)。
3.2 電子鼻氣味信息測(cè)定結(jié)果
電子鼻10個(gè)傳感器對(duì)不同的化合物敏感，Loading分析結(jié)果（圖2A）顯示，不同基原大黃飲片氣味差異成分主要是S7（無機(jī)硫化物）、S9（芳香成分有機(jī)硫化物）、S6（甲烷等短鏈烷烴）、S8（醇醚醛酮類）、S2（氮氧化合物）。選取差異最大的S7（無機(jī)硫化物）120 s內(nèi)的實(shí)時(shí)響應(yīng)值繪制顏色映射瀑布圖（圖2B），結(jié)果顯示，3種基原大黃飲片存在明顯差異。PLS-DA、OPLS-DA（圖2C、圖2D）結(jié)果顯示：在PLS-DA中，主成分1占比為98.2%，主成分2占比為1.21%，可信度為95%；
在OPLS-DA中，主成分1占比為97.50%，主成分2占比為1.03%，可信度為95%；
圖中不同基原大黃飲片間無重疊，聚集在不同區(qū)域，說明不同基原大黃飲片氣味差異明顯。同時(shí)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)定檢驗(yàn)數(shù)為200次，R2和Q2為該模型評(píng)價(jià)指標(biāo)（分別代表其可解釋度和預(yù)測(cè)能力），結(jié)果（圖2E）左邊的R2點(diǎn)和Q2點(diǎn)均低于右邊，表明未產(chǎn)生過擬合，模型可靠。根據(jù)VIP篩選3種基原大黃差異性氣味成分，其中VIP大于1的表明對(duì)差異貢獻(xiàn)大，反之則表明對(duì)差異貢獻(xiàn)小[15]。結(jié)果（圖2F）顯示，3種基原大黃飲片差異主要來自S7（無機(jī)硫化物）、S9（芳香成分有機(jī)硫化物）、S6（甲烷等短鏈烷烴）、S8（醇醚醛酮類），而S1（芳香成分，苯類）、S2（氮氧化合物）、S3（氨水，芳香成分）、S4（氫氣）、S5（烷烴芳香成分）、S10（長(zhǎng)鏈烷烴類）的影響小，與Loading分析結(jié)果一致。
圖2 電子鼻氣味檢測(cè)數(shù)據(jù)分析結(jié)果
3.3 GC-IMS揮發(fā)性有機(jī)物測(cè)定結(jié)果
8批大黃飲片中共檢測(cè)出83個(gè)揮發(fā)性有機(jī)物信息，包括醛類成分22個(gè)、酯類成分14個(gè)、酮類成分14個(gè)、醇類成分14個(gè)、酸類成分7個(gè)、萜烯類成分6個(gè)以及其他類成分6個(gè)。GC-IMS俯視圖（圖3）中橫坐標(biāo)處紅色豎線為RIP峰（反應(yīng)離子峰），RIP峰兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表1種揮發(fā)性有機(jī)物。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較小，紅色表示濃度較大，顏色越深表示濃度越大。結(jié)果顯示，藥用大黃飲片中的揮發(fā)性有機(jī)物濃度明顯小于其他2種基原飲片，并且唐古特大黃飲片在保留時(shí)間200～400 s之間的出峰數(shù)量以及峰強(qiáng)度均多/高于其他2種基原飲片，掌葉大黃飲片在保留時(shí)間600～700 s之間的峰強(qiáng)度高于其他2種基原飲片，這為后續(xù)鑒別不同基原的大黃飲片提供了可能。
圖3 不同基原大黃飲片GC-IMS俯視圖譜
依據(jù)特征峰選取原則，通過GC-IMS將選取的不同基原大黃飲片中不同揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)應(yīng)的特征峰區(qū)域進(jìn)行排序對(duì)照，得到指紋圖譜（圖4），可直觀快速地看出揮發(fā)性有機(jī)物在不同基原大黃飲片中的特異性以及樣品之間的差異。結(jié)果顯示，藥用大黃飲片中含量高于其他2種基原飲片的主要特征物質(zhì)有2-乙酰基呋喃、正己酸乙酯等；
掌葉大黃飲片中含量高于其他2種基原飲片的主要特征物質(zhì)有4-甲基-3戊烯-2-酮[二聚體]、乙酸甲酯[二聚體]等；
唐古特大黃飲片中含量高于其他2種基原的主要特征物質(zhì)有1-戊醇、叔丁醇[單體]、庚醛[單體]等。通過分析、計(jì)算不同基原大黃飲片的所有揮發(fā)性物質(zhì)峰強(qiáng)度信息，建立大黃飲片基原的判別標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)2-乙酰基呋喃峰強(qiáng)度是異丁酸[二聚體]峰強(qiáng)度的3～19倍時(shí)為藥用大黃飲片；
當(dāng)4-甲基-3戊烯-2-酮[二聚體]是四氫呋喃[二聚體]峰強(qiáng)度的2～9倍、3-羥基-2-丁酮[二聚體]峰強(qiáng)度是四氫呋喃[二聚體]峰強(qiáng)度的5～14倍時(shí)為掌葉大黃飲片；
當(dāng)2-己烯醛[單體]峰強(qiáng)度是仲丁醇[單體]峰強(qiáng)度的5～11倍、正戊醛[二聚體]峰強(qiáng)度是仲丁醇[單體]峰強(qiáng)度的13～21倍、1-戊醇峰強(qiáng)度是仲丁醇[單體]峰強(qiáng)度的5～9倍、1-戊烯-3-酮峰強(qiáng)度是仲丁醇[單體]峰強(qiáng)度的8～17倍時(shí)為唐古特大黃飲片。
圖4 不同基原大黃飲片GC-IMS指紋圖譜
對(duì)不同基原大黃飲片揮發(fā)性有機(jī)物峰強(qiáng)度信息進(jìn)行PCA和PLS-DA，結(jié)果（圖5）顯示，藥用大黃、掌葉大黃和唐古特大黃各自聚集，說明不同基原大黃飲片間氣味差異大，相同基原間相似度較高，可較好地區(qū)分不同基原大黃飲片。
電子舌檢測(cè)結(jié)果表明，不同基原大黃飲片滋味差異主要表現(xiàn)在苦味、澀味及苦和澀的回味，且唐古特大黃飲片澀味最強(qiáng)，掌葉大黃飲片苦味最強(qiáng)。文獻(xiàn)研究表明，澀味差異的產(chǎn)生與鞣質(zhì)類成分含量相關(guān)，而苦味差異的產(chǎn)生與其蒽醌類、萜類、生物堿類成分含量相關(guān)[16]。另有研究證實(shí)，唐古特大黃的鞣質(zhì)類成分含量高于藥用大黃及掌葉大黃，而掌葉大黃的游離蒽醌類成分含量高于唐古特大黃及藥用大黃。因此電子舌檢測(cè)結(jié)果將上述研究報(bào)道進(jìn)行了有效串聯(lián)，也進(jìn)一步證實(shí)了不同基原大黃飲片所含化學(xué)成分存在明顯差異，提示其臨床應(yīng)用應(yīng)有所區(qū)分。
電子鼻檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同基原大黃飲片氣味差異成分主要是無機(jī)硫化物、芳香成分有機(jī)硫化物、甲烷等短鏈烷烴、醇醚醛酮類化合物；
而GC-IMS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同基原大黃飲片的差異揮發(fā)性氣味物質(zhì)主要是醇醛酮酸類成分，表明GC-IMS與電子鼻檢測(cè)結(jié)果具有較強(qiáng)相關(guān)性，同時(shí)也進(jìn)一步說明了醇醛酮類成分是3種基原大黃飲片間的主要差異氣味物質(zhì)。
綜上，本研究采用的電子舌、電子鼻及GC-IMS技術(shù)可有效分析3種不同基原大黃飲片的滋味差異、氣味組成及揮發(fā)性物質(zhì)差異，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析建立了多種大黃飲片基原鑒別模型以及基原判別標(biāo)準(zhǔn)，可用于快速區(qū)分大黃飲片的基原，為豐富和發(fā)展大黃飲片傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別增添了新的思路。但由于GC-IMS定性分析軟件內(nèi)置的NIST、IMS數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物數(shù)量有限，有12個(gè)信號(hào)峰尚未定性表征，下一步可以結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)充，進(jìn)一步完善大黃飲片不同基原的氣味差異，為大黃飲片基原精準(zhǔn)鑒定及臨床使用提供更多數(shù)據(jù)支撐。
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