對照。接種后，置于培養室25℃培養，觀察菌種的萌發、走菌情況，當菌絲生長至袋口端邊緣4～5 cm時，畫一起始線，當生長最快的菌絲即將長滿菌種袋時再畫一終止線，記錄培養時間，測量菌絲生長長度，計算菌絲生長速度。

1.3響應面方法的試驗設計與數據分析

1.3.1Plackett-Burman試驗設計和結果分析方法 根據前期單因素試驗結果和雙孢蘑菇W192液體發酵培養的文獻報道，按照Plackett-Burman試驗設計，以雙孢蘑菇W38菌絲體生物量為指標，選取發酵培養基組分和培養條件的8個因素作為考察對象，利用Design-Expert8.0統計軟件對試驗結果進行各個因素的顯著性分析。

1.3.2Box-Behnken試驗設計和結果分析方法 通過Design-Expert8.0軟件對Plackett-Burman試驗結果進行分析，得到3個對雙孢蘑菇W38菌絲體生物量影響極其顯著的因素，然后進行3因素3水平的17組Box-Behnken中心組合設計試驗，中心點編碼為0，試驗的實際濃度選取Plackett-Burman試驗中高低水平濃度的中間值，經計算，小米粉為40 g·L^-1、黃豆粉為12.5 g·L^-1、MgSO₄·7H₂O為1.0 g·L^-1，其余因素濃度取初始配方值。

2結果與分析

2.1Plackett-Burman試驗

按照Plackett-Burman篩選試驗設計，考察小米粉（X₁）、黃豆粉（X₂）、K₂HPO₄（X₃）、MgSO₄·7H₂O（X₄）、發酵培養溫度（X₅）、培養基初始pH（X₆）、發酵培養時間（X₇）、搖瓶轉數（X₈）8個因素對雙孢蘑菇W38菌絲體生物量的影響。試驗設計及其結果如表1，各因素均取高（1）、低（-1）2個水平，按照設計表格的試驗號依次進行試驗，所得y值為雙孢蘑菇W38菌絲體生物量。

利用Design-Expert8.0統計軟件對以上結果進行回歸分析，結果如表2所示，對雙孢蘑菇W38菌絲體生物量的影響達到極顯著水平（P<0.01）的因素有小米粉（X₁）、黃豆粉（X₂）和MgSO₄·7H₂O（X₄），其他5個因素對菌絲體生物量影響不顯著（P>0.05）。由此，選擇小米粉、黃豆粉和MgSO₄·7H₂O這3個重要影響因素進行Box-Behnken中心組合設計試驗。

2.2響應面優化試驗

2.2.1中心組合設計和響應面分析結果 表3為Box-Behnken中心組合設計的因素及水平，試驗結果見表4。采用Design-Expert&O軟件對試驗結果進行處理，得到二次響應面回歸方程：Y=2.04+0.30 X₁+0.11X₂-0.0031X₄-0.053X₁X₂+0.025X₁X₄+0.050X₂X₄-0.039X²₁-0.084X²₂-0.081X²₄，參數見表5，方程中的X₁、X₂、X₁X₂、X²₂、X²₄對雙孢蘑菇w38菌絲體生物量影響極顯著（P<0.01）。在培養基配方的各成分中，小米粉和黃豆粉對菌絲體生物量的影響最大。對所得數據進行回歸分析，結果如表6所示，回歸方程P<0.000 1，表明回歸模型極顯著；回歸方程具有較高的決定系數（R²=0.993 3）和不顯著的失擬系數（P=0.239 8），表明模型擬合程度理想，可以用于雙孢蘑菇W38液體菌種菌絲體生物量的理論預測。

圖1～3是根據響應面回歸分析和回歸方程擬合繪出的響應面三維分析圖和等高線圖形，圖1～3分別將MgSO₄·7H₂O、小米粉和黃豆粉中的1個因子分別固定在中心點水平，可以直觀分析出其他2因素及其交互作用對雙孢蘑菇W38液體菌種菌絲體生物量影響效應的大小。圖1和圖2的等高線圖呈橢圓形，說明X₁（小米粉）和X₂（黃豆粉）及X₄（MgSO₄·7H₂O）和X₂（黃豆粉）之間的交互作用顯著；而圖3的等高線圖呈圓形，說明X₁（小米粉）和X₄（MgSO₄·7H₂O）之間的交互作用不顯著。

2.2.2液體培養基最優組合 運用Design-Expert8.0軟件計算出最大響應值所對應的X₁、X₂、X₄分別為0.99、0.44、0.27，自變量實際取值X₁為49.90 g·L^-1，X₂為13.60 g·L^-1，X₄為1.067 5g·L^-1，此時最大響應值為每100 mL菌絲體2.31g。因此，雙孢蘑菇W38液體菌種最優培養基和培養條件為：小米粉49.90 g·L^-1，黃豆粉13.60g·L^-1，KH₂PO₄ 2.00 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O1.067 5 g·L，初始pH 6.5，發酵時間7 d，發酵溫度24℃，搖瓶轉速180 r·min^-1。

2.2.3響應面模型的驗證 在優化后的培養基和培養條件下進行3次平行驗證實驗，雙孢蘑菇W38液體菌種的平均每100 mL菌絲體干重為2.35 g，與預測值接近，即擬合度良好。比初始培養基（基礎培養基）液體發酵培養的雙孢蘑菇W38菌絲體每100 mL干重為0.58 g，提高了3.05倍。

2.2.4液體菌種活力檢驗 向麥粒培養基中接入10mL優化配方培養的雙孢蘑菇W38液體菌種，以基礎培養基培養的液體菌種為對照，重復3次，每次10袋，共30袋，進行菌種活力測定，測量菌絲生長長度，計算平均菌絲生長速度。由表7可知，優化配方的液體菌種菌絲萌發時間為36 h，比基礎配方的液體菌種萌發時間48 h縮短12 h，而且在麥粒培養基中生長的菌絲密度濃密，顏色濃白；經計算，優化配方的液體菌種在麥粒培養基的平均菌絲生長速度3.27 mm·d^-1，較初始配方的液體菌種平均菌絲生長速度2.85 mm·d^-1快14.7%，差異極顯著（P<0.01）。

3討論與結論

本研究利用Design-Expert軟件，采用Plackett-Burman設計和中心組合設計，建立了二次響應面回歸模型，優化了雙孢蘑菇W38液體菌種培養基和培養條件。在Plackett-Burman設計中篩選出影響菌絲體生物量的主效因素為小米粉、黃豆粉和MgSO₄·7H₂O，這與雙孢蘑菇W192液體發酵培養基的優化所篩選主因素為玉米淀粉、黃豆粉和搖瓶轉數不同。雙孢蘑菇菌株W38與菌株W192雖具有較近的親緣關系，但它們的液體發酵培養所篩選的主因素不同可能是雙孢蘑菇菌株的差異性所致。通過液體菌種活力檢測，優化配方培養的雙孢蘑菇W38液體菌種比基礎配方培養的菌種平均菌絲生長速度快14.7%，差異達極顯著（P<0.01）水平，說明以菌絲生物量為指標，響應面法優化配方可以提高雙孢蘑菇W38液體菌種活力。

本研究在實驗室條件下，通過搖瓶發酵培養，獲得雙孢蘑菇W38液體菌種，再作為原種轉接麥粒培養基中培養，液體菌種萌發和菌絲生長情況良好，這證實了雙孢蘑菇液體菌種作為原種轉接固體培養基的可行性。液體菌種的培養基和培養條件的優化只是液體菌種制種工藝初步階段，還有待完善液體菌種接種量、接種方式以及發酵罐深層發酵培養的技術參數等。通過響應面分析法確定雙孢蘑菇W38最佳的培養基和培養條件為：小米粉49.90 g·L^-1，黃豆粉13.60 g·L^-1，KH₂PO₄2.00 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 1..07 g·L^-1，初始pH 6.5，發酵時間7 d，發酵溫度24℃，搖瓶轉速180 r·min。在此條件下，雙孢蘑菇W38液體菌種的每100 mL菌絲體生物量可達2.35 g，與初始培養條件下的菌絲體生物量相比提高了3.05倍。本研究得到的液體培養基優化配方可以為雙孢蘑菇W38在發酵罐中深層發酵培養提供參考。

（責任編輯：黃愛萍）

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