石娜娜，袁成磊
(濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262500)
生姜(ZingiberOfficinaleRoscoe)是一種重要的高效高產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)作物，兼具藥用和食用價(jià)值。山東省獨(dú)特的地理?xiàng)l件非常適合生姜種植，其中濰坊地區(qū)種植面積較大，但近幾年每到7、8月份都會(huì)有持續(xù)的高溫陰雨天氣，使生姜莖基腐病逐年加重，尤其是大雨過(guò)后，菌體孢子隨雨水到處傳播，導(dǎo)致生姜大面積死棵，嚴(yán)重制約著當(dāng)?shù)厣N植業(yè)的發(fā)展，很多老姜區(qū)的生姜種植面積急劇減少，比如安丘白芬子、昌樂(lè)紅河、昌邑南逄、青州東夏等。
生姜莖基腐病又稱(chēng)為爛脖子病，是一種典型的土傳病害，為真菌性病害，對(duì)生姜產(chǎn)生的危害較為嚴(yán)重，會(huì)導(dǎo)致枝條或全株枯死，是繼姜瘟后又一個(gè)急需解決的災(zāi)變病害。元菊丹[1]發(fā)現(xiàn)山東省安丘市、昌樂(lè)市等生姜栽培基地普遍發(fā)生莖基腐病，病情嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)30%-70%，重病區(qū)大田中的生姜腐爛絕收，給姜農(nóng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前通過(guò)處理生姜莖基腐病殘?bào)w分離培養(yǎng)出多種病菌，包括瓜果腐霉、姜腐霉、群結(jié)腐霉、鐘器腐霉、禾生腐霉、刺腐霉、巴特勒腐霉和德里腐霉等多種霉菌，其中印度以瓜果腐霉分布范圍最廣、致病性最強(qiáng)；
斐濟(jì)以群結(jié)腐霉為優(yōu)勢(shì)病原菌；
澳大利亞多以群結(jié)腐霉和姜腐霉為主；
日本的主要病原菌為姜腐霉；
韓國(guó)以姜腐霉為優(yōu)勢(shì)病原菌[2]。國(guó)內(nèi)對(duì)生姜莖基腐病的病原研究報(bào)道并不多，目前己發(fā)現(xiàn)的生姜莖基腐病主要致病菌為瓜果腐霉、群結(jié)腐霉以及合生腐霉[3]。劉振偉[4]發(fā)現(xiàn)萊蕪生姜產(chǎn)區(qū)的病原菌即為群結(jié)腐霉。
長(zhǎng)期以來(lái)姜農(nóng)主要依賴(lài)三唑酮、甲霜靈、代森錳鋅等化學(xué)農(nóng)藥防治莖基腐病，但長(zhǎng)期大量的使用，使病原菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，同時(shí)化學(xué)農(nóng)藥的使用使自然生態(tài)，如水體、大氣和土壤受到嚴(yán)重污染，部分農(nóng)藥殘留可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，威脅人類(lèi)健康[5]，因此明確該病病原、發(fā)生規(guī)律，篩選特定拮抗菌進(jìn)行生物防治顯得尤為重要。土壤中微生物種類(lèi)多樣，數(shù)量龐大，功能豐富，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的生防微生物以芽孢桿菌居多，芽孢桿菌屬微生物在自然界中種類(lèi)豐富、廣泛存在，同時(shí)大量研究發(fā)現(xiàn)該種屬菌群具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗逆性等諸多功能。陳志誼[6]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在受到外界不良環(huán)境時(shí)，可以產(chǎn)生耐熱、耐鹽、抗紫外的內(nèi)生芽孢，而且由于代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有很好的抗病促生作用，被廣泛應(yīng)用到生物防治中。王璐瑤[7]對(duì)篩選的5株甘薯莖腐病拮抗菌株進(jìn)行鑒定，其中4株拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌，另外1株為枯草芽胞桿菌。
國(guó)家十四五規(guī)劃提出要加快生態(tài)文明建設(shè)，科學(xué)利用微生物進(jìn)行生物防治，以菌防菌，以菌治菌，通過(guò)安全環(huán)保的方法達(dá)到病蟲(chóng)害防治效果，正好符合綠色發(fā)展的理念，可以有效促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色循環(huán)可持續(xù)發(fā)展。以標(biāo)準(zhǔn)模式病原菌群結(jié)腐霉為靶標(biāo)，從根際土壤中進(jìn)行菌種篩選，針對(duì)病原菌篩選拮抗菌與促生菌，可為田間生姜莖基腐病的生物防治提供功能良好的潛力生防菌。將為生姜莖基腐病的生物防治提供理論依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
1.1 供試土樣
2020年7月-2022年9月，采集青州東夏鎮(zhèn)及周邊生姜種植區(qū)根際土壤樣本200 份。
1.2 供試病原菌
群結(jié)腐霉(Pythiummyriotylum)，由青州市利民農(nóng)化有限公司實(shí)驗(yàn)室分離并保存。
1.3 供試大姜品種
生姜品種“山農(nóng)一號(hào)”，購(gòu)自濰坊寒亭朱里鎮(zhèn)農(nóng)資。
1.4 培養(yǎng)基及試劑
培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基、查氏酵母膏瓊脂，具體配制參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[8]。
1.5 所需儀器
SGSP-02 水隔式恒溫培養(yǎng)箱，湖北黃石醫(yī)療器械廠(chǎng)；
HQL300B 柜式恒溫冷凍搖床，武漢中科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；
日立CR21G 高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；
SHS-2 電熱恒溫水浴鍋，湖北黃石醫(yī)療器械廠(chǎng)；
722 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海奧譜勒儀器有限公司；
超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；
PCR儀，Eppendorf 公司；
YX-280A 手提式不銹鋼蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；
HP250GS 智能人工氣候箱，武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司。
2.1 土樣的采集
通過(guò)五點(diǎn)取樣法對(duì)青州東夏鎮(zhèn)及周邊生姜種植區(qū)內(nèi)的土樣進(jìn)行采集，選取地面以下 10 cm-15cm 處深的土壤，每點(diǎn)取40g土樣，用無(wú)菌自封袋裝好并進(jìn)行編號(hào)，存置于4℃冰箱中保存，備用。
2.2 拮抗菌株的初篩
2.2.1 土壤微生物的分離
取土壤樣品10g，置于裝有90mL無(wú)菌水的250mL三角瓶中，輕輕加入10顆小玻璃珠，先靜置20min，然后在150r/min的搖床上震蕩30min，制成土壤菌懸液。
吸取土壤菌懸液1mL，放入裝有9mL無(wú)菌水的試管中，在漩渦震蕩儀上混勻震蕩，繼續(xù)10倍梯度稀釋?zhuān)x擇3個(gè)合適的稀釋度，從稀釋液中吸取0.1mL，加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基中涂布均勻，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行，30℃恒溫培養(yǎng)3-4d。
在超凈工作臺(tái)中，采用分區(qū)劃線(xiàn)分離法對(duì)平板中長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行分離純化，37℃恒溫培養(yǎng)48h。純化好的純種菌株可制備成30%甘油管，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2.2 拮抗菌株的初篩
以模式病原菌為耙標(biāo)真菌，將所制備的細(xì)菌進(jìn)行液體活化，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.5-0.6)的發(fā)酵液，與融化后的固體PDA培養(yǎng)基以1:5(體積比)進(jìn)行混合，制備成固體初篩平板培養(yǎng)基。
用直徑為8mm的打孔器將群結(jié)腐霉模式病原菌的菌餅接入固體初篩平板培養(yǎng)基的中心位置，28℃恒溫培養(yǎng)5d后，檢測(cè)抑菌效果。利用以下公式計(jì)算抑制率大小，并以抑菌圈、抑菌率及初篩菌株菌落擴(kuò)散生長(zhǎng)情況作為初篩依據(jù)。抑菌半徑大于1.5cm的菌株對(duì)指示菌的生長(zhǎng)與繁殖具有較顯著抑制作用[9]。試驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)置對(duì)照。
2.3 拮抗菌株復(fù)篩
2.3.1 對(duì)篩選到能分泌IAA的細(xì)菌進(jìn)行分泌量測(cè)定試驗(yàn)
將初篩菌株進(jìn)行活化后，接入含有L-色氨酸(100mg/L)的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管(裝液量為5ml)中，于30℃、180r/min搖床中恒溫培養(yǎng)24h。取活化后菌懸液200μL，分別加入到96孔酶標(biāo)板中，以加入200μL菌懸液到無(wú)菌牛肉膏液體培養(yǎng)基中為對(duì)照，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定菌懸液OD600nm值，記錄數(shù)據(jù)。每個(gè)待測(cè)菌株做3個(gè)平行。
取菌懸液1mL加入1.5mL離心管，10000r/min離心10min，吸100μL上清液加入到96孔酶標(biāo)板，同時(shí)每孔加入100μL吲哚乙酸比色液，室溫避光靜置30min，取出后立即通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定OD530nm值。
對(duì)照加入100μL牛肉膏液體培養(yǎng)基和100μL吲哚乙酸比色液。
2.3.2 繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)液：將0.5mol/L的FeCl3與35%的HClO4，以1:50的體積比混勻，用來(lái)配制不同濃度梯度IAA(分析純)比色液。
配制IAA的濃度梯度為0，25，50，75，100，125，150，175，200mg/L，分別吸取100μL加入到96孔酶標(biāo)板，并加入等體積吲哚乙酸比色液，避光靜置30min，取出立即測(cè)定其OD530nm值。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1)。
圖1 IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖
2.4 拮抗菌株的鑒定
2.4.1 細(xì)菌菌株的生理生化鑒定
細(xì)菌菌株的生理生化鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第9版。
2.4.2 霉菌鑒定
霉菌菌株的鑒定主要以菌落和形態(tài)學(xué)特征為主，以真菌分類(lèi)工具書(shū)[10]為依據(jù)，觀(guān)察菌株生長(zhǎng)過(guò)程中菌落的形狀、顏色、生長(zhǎng)速度、平板正反面差異、菌落邊緣和表面質(zhì)地、氣味、菌絲高矮粗細(xì)、孢子顏色等。
菌落特征的觀(guān)察：待測(cè)菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，觀(guān)察菌株整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)的速度、菌落的顏色、形態(tài)以及正反面的差別等。
水浸片形態(tài)觀(guān)察：在載玻片上滴加一滴蒸餾水，用解剖針從生長(zhǎng)有霉菌的平板中挑取少量帶孢子的霉菌菌絲，用50%的乙醇浸潤(rùn)，蒸餾水清洗，然后放入載玻片的液滴中，仔細(xì)地用解剖針將菌絲分散開(kāi)來(lái)。蓋上蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡，且不要再移動(dòng)蓋玻片)，先用低倍鏡，必要時(shí)轉(zhuǎn)換高倍鏡鏡檢并記錄觀(guān)察結(jié)果。
3.1 拮抗菌株的篩選
3.1.1 生長(zhǎng)勢(shì)篩選
對(duì)分離得到的312株菌株的生長(zhǎng)能力進(jìn)行篩選，其中生長(zhǎng)勢(shì)(菌落大小、培養(yǎng)時(shí)間)比較好的菌株102株，準(zhǔn)備進(jìn)行拮抗菌初篩試驗(yàn)。
3.1.2 拮抗菌株的初篩
對(duì)分離得到的102株菌株以抑菌率及抑菌半徑為指標(biāo)進(jìn)行初篩，發(fā)酵液平均抑菌率如下表1所示，得到拮抗效果較好的菌株20株。
表1 篩選菌株的抑菌率%和抑菌半徑/cm
3.1.3 拮抗菌株的復(fù)篩
將初篩得到的20種菌株，進(jìn)行IAA分泌量測(cè)定，取3個(gè)平行的平均值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，計(jì)算單位體積菌懸液中IAA的含量。
結(jié)果表明，20株細(xì)菌的IAA分泌量有效區(qū)間為0.37～62.88 mg/L，其中有6株菌(30%)IAA分泌量大于30mg/L；
有10株菌(50%)IAA分泌量在0.37～30mg/L之間，有4株菌(20%)IAA分泌量較小，不在正常計(jì)算值范圍內(nèi)。以模式菌株枯草芽孢桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照，有5株菌IAA分泌量高于陽(yáng)性對(duì)照菌
株(35.24±4.23mg/L)。具體結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 菌株IAA分泌量mg/L
3.2 菌株間拮抗性
將復(fù)篩得到的5株菌，進(jìn)行菌株間拮抗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MS8、M1間有拮抗性，最后選取抑菌率較高的3株菌得復(fù)合菌劑，即細(xì)菌B4、B26，霉菌M67。
3.3 細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析
將菌株B4和B26的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序后，提交至NCBI Genebank ，獲得B4和B26的序列號(hào)分別為JQ796652和JQ796651。基因序列與Genebank的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì) (Blast) ，結(jié)果顯示，菌株B4和B26分別同Bacillustequilensis(HQ223107)和Bacillussubtilis(CJ2JN972432) 的相似性達(dá)到99%。使用軟件mega4.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初步鑒定菌株B4和B26為龍舌蘭芽孢桿菌(Bacillustequilensis)和枯草芽胞桿菌 (Bacillussubtilis) ，如圖2所示。
圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
3.4 細(xì)菌菌株的生理生化鑒定
菌株B4和B26均在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，兩者的細(xì)胞形態(tài)及部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。根據(jù)生理生化結(jié)果及細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定菌株B4為龍舌蘭芽孢桿菌(Bacillustequilensis)、B26為枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)。
表3 菌株B4和B26形態(tài)學(xué)特征和生理生化特點(diǎn)
對(duì)真菌(M67)進(jìn)行形態(tài)學(xué)和水浸片觀(guān)察，兩株菌在PDA上生長(zhǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)4-7天，發(fā)現(xiàn)菌落在PDA平板上蔓延迅速，菌絲初為白色，后變成鮮黃色，最后變?yōu)楹谏q狀，菌落中有放射性褶皺，培養(yǎng)基背面無(wú)色或略帶黃色；
孢子形態(tài)為頂囊大球形，小梗雙層，分生孢子為球形，呈黑、黑褐色，平滑。分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌絲細(xì)胞(足細(xì)胞)上垂直生出；
分生孢子頭狀如“菊花”(圖3)。根據(jù)兩株菌的形態(tài)特征和水浸片觀(guān)察，以《真菌鑒定手冊(cè)》和《真菌的形態(tài)和分類(lèi)》為依據(jù)進(jìn)行鑒定，初步確定M67為黑曲霉(Aspergillusniger)。
3.5 霉菌鑒定
圖3 M67的菌落及顯微鏡下菌絲體與孢子形態(tài)
以莖基腐病模式菌株為靶菌，將青州東夏鎮(zhèn)生姜種植區(qū)田間土壤、自然堆體、朽木等采集的樣品利用發(fā)酵液平板進(jìn)行初篩，篩選到抑菌效果較好的菌株20株，以IAA分泌量進(jìn)行復(fù)篩，獲得促生效果較好的菌株5株，其中細(xì)菌4株，霉菌1株。對(duì)這5株菌進(jìn)行拮抗性實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)各菌株抑菌率的高低排序，最后得到抑菌能力較強(qiáng)的3株菌，即細(xì)菌B4、B26，霉菌M67。生理生化實(shí)驗(yàn)及利用16S rDNA構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)可知，B4為龍舌蘭芽孢桿菌(Bacillustequilensis)、B26為枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis) 。根據(jù)菌落形態(tài)及顯微鏡下菌絲體及孢子形態(tài)特征，初步鑒定M67為黑曲霉(Aspergillusniger)。
芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)是植物根際土壤中較為普遍的微生物類(lèi)群，其中的很多種類(lèi)可通過(guò)分泌抗菌物質(zhì)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗病性等機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗病促生作用[11]。研究篩選的芽孢桿菌和黑曲霉對(duì)生姜莖基腐病病原菌群結(jié)腐霉有明顯的拮抗作用，下一步將制備復(fù)合微生物菌劑進(jìn)行生物防治，為生姜莖基腐病的生物防治提供理論依據(jù)與實(shí)踐指導(dǎo)。
但復(fù)合微生物菌劑的抑菌機(jī)理目前還不明確，需要進(jìn)一步研究。
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