聞丹妮 鮑聆然 劉蒙蒙 沈 波
（杭州師范大學生命與環境科學學院，311121，浙江杭州）
水稻是重要的糧食作物，提高其產量和擴大其種植面積對確保世界糧食安全具有舉足輕重的作用。鹽脅迫是影響水稻產量的主要因素之一，其主要危害是產生離子毒性和滲透脅迫，干擾細胞質中的K+/Na+穩態，導致胞漿K+/Na+比值降低[1]。根系作為水稻生長發育必不可少的器官，直接接觸土壤中的鹽離子，并在離子運輸中起著關鍵作用，是最先感受逆境脅迫的器官[2]。過量的Na+和Cl–積累導致離子失衡，損害根系細胞膜的選擇性，從而間接影響水稻地上部產量、品質和抗逆性等諸多農藝性狀的表現[3-4]。
WD40蛋白在真核生物中極其豐富，且高度保守[5]。WD40結構域可介導蛋白質―蛋白質或蛋白質―DNA相互作用，從而形成動態復合物或者作為支架蛋白發揮作用，調節多種細胞過程，參與RNA處理、核輸出、細胞分裂調控、信號轉導和激素反應等重要的細胞活動[6-9]。Xu等[10]發現，擬南芥WD40蛋白XIW1與核轉運受體XPO1相互作用，促進脫落酸（ABA）響應并抑制種子萌發，同時促進鹽脅迫對種子萌發的抑制作用。Kong等[11]在小麥中鑒定出1個TaWD40D新基因，表現為鹽脅迫和滲透脅迫響應的正向調控因子。而在水稻鹽脅迫響應的全基因組分析中，發現5個編碼對鹽脅迫有響應的WD40蛋白基因（SRWD1～SRWD5），其中，SRWD1的表達可能與水稻品種對鹽脅迫的敏感性相關[12]。這些結果說明，WD40蛋白在植物鹽脅迫反應中具有重要作用。
目前，轉錄組測序（RNA-Seq）技術已成為研究基因表達譜的常用方法，如對耐鹽水稻Xian 156和鹽敏感水稻IR28進行轉錄組分析，發現激素和鈣的信號傳導途徑、離子代謝和轉移、氮代謝和次生代謝等參與對鹽脅迫的響應[13]。本實驗室前期運用生物信息學和同源克隆的方法，在水稻中找到了1個編碼WD40重復蛋白的基因OsWD40，通過轉基因技術獲得OsWD40過表達水稻株系。OsWD40編碼1個功能未知的含7個WD40重復序列的蛋白質，其表達受到NaCl脅迫及ABA影響。前期試驗[14]顯示，OsWD40過表達水稻株系在200mmol/L NaCl處理12、24和48h時的根系活力均高于日本晴，分別為日本晴的1.30、1.90和3.85倍。本研究主要對鹽脅迫下OsWD40過表達水稻苗期根系進行轉錄組分析，以期揭示OsWD40參與耐鹽的分子機制。
1.1 試驗材料
本研究所用水稻材料為日本晴（Oryza sativa L.ssp.japonica.cv.Nipponbare）和以日本晴為受體的T6代OsWD40過表達轉基因水稻株系。
1.2 試驗設計
1.2.1 鹽脅迫處理 日本晴和OsWD40過表達株系種子經浸種和催芽后，移入96孔植物水培盒，在30℃光照培養箱內培養，光照強度12 000lx，光照周期為14h光照/10h黑暗。待水稻幼苗2周齡時，用含200mmol/L NaCl的水稻營養液處理，分別在0、12、24和48h時對根系取樣，液氮速凍，存入-80℃低溫冰箱。委托杭州聯川生物技術股份有限公司完成RNA的提取、質控、建庫及Illumina Novaseq?6000測序工作，每個時間點取樣均進行3次重復。
1.2.2 原始數據的過濾與組裝 使用cutadapt軟件對下機原始數據進行去除接頭處理，然后對數據進行去除低質量序列和重復序列后得到有效數據。使用HISAT2將得到的有效數據比對到日本晴水稻參考基因組上。使用StringTie軟件對基因或轉錄本進行初組裝，將所有樣本的初組裝結果進行合并，用gffcompare軟件檢測轉錄本與參考注釋的比較得到最終的組裝注釋結果。
1.2.3 差異表達基因篩選及功能富集分析 使用ballgown包提供文件輸入進行FPKM定量。采用DEGseq 2軟件比較日本晴和OsWD40過表達株系在鹽脅迫相同時間（分別記為ST0 vs NT0、ST12 vs NT12、ST24 vs NT24和ST48 vs NT48）的基因表達量，并進行顯著差異分析，將差異倍數在2倍以上，即Fold Change≥2倍或Fold Change≤0.5倍且P＜0.05的基因定義為差異基因，將其注釋到GO和KEGG數據庫中，獲得差異表達基因的功能注釋及相關代謝通路信息。
1.2.4 qRT-PCR驗證 參照RNA提取試劑盒（康為世紀生物科技股份有限公司）說明書提取水稻根系總RNA。用NanoDrop檢測RNA質量和濃度。參照HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書合成cDNA的第1條鏈。根據已知的基因序列，設計引物（表1）。參照SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa公司）說明書進行實時熒光定量PCR，在CFX96TM型熒光定量PCR儀（BIO-RAD）中進行擴增反應，每個反應重復3次。基因相對表達量計算方法采用 2-ΔΔCT。
表1 熒光定量引物及序列Table 1 The primer and sequences of qRT-PCR
1.3 數據處理
采用SPSS 20.0進行單因素方差分析（oneway ANOVA），以Duncan’s進行多重比較，利用SigmaPlot 10.0軟件進行作圖。
2.1 測序質量分析
測序樣品產生的原始數據經去除低質量和帶測序接頭的數據后，其每個樣本的Q20%（測序錯誤率小于0.01）均在99.97%及以上，Q30%（測序錯誤率小于0.001）均大于97.97%，GC含量在50.5%～52.5%，有效數據占原始數據的比例在93.34%～96.98%（表2），說明數據的可靠性高。以日本晴為參考基因組，將短數據比對到參考基因組上，每個樣本的比對率均在88.71%及以上，雙端比對率均在72.54%～84.38%。與此同時，比對到參考基因組的正鏈和負鏈的數據量相近，進一步說明測序數據的高準確性。
表2 各樣本測序總數量及有效數據在參考基因組上的比對Table 2 The number of sequencing obtained from each sample and the clean reads mapped to the reference genome
2.2 樣本關系分析
樣本間的主成分分析（圖1a）顯示，對照（0h）與鹽脅迫樣本間距離較遠，說明鹽脅迫導致各樣本在基因表達水平上發生顯著的差異。與此同時，日本晴鹽脅迫24與48h的樣本聚集在一起，樣本間基因表達水平差異較小，而OsWD40過表達株系鹽脅迫24與48h的樣本之間距離相對較遠，基因表達水平差異較大，說明OsWD40過表達株系在鹽脅迫后的表達響應具有持續性。從測序樣本相關性熱圖（圖1b）可知，相同處理測序樣品間Pearson相關性系數極高（R＞0.990），不同處理及品種間樣品基因表達水平存在較大差異，相關性系數小，說明相同處理測序樣品間重復性高，系統誤差較小，結果可信度極高。
圖1 測序樣本關系Fig.1 The relationship of all surveyed samples
2.3 差異表達基因分析
轉錄組測序數據（圖2）顯示，鹽處理0、12、24和48h，OsWD40基因在過表達株系的表達量分別為317.97、280.65、183.68和93.45，而在日本晴中的表達量均小于1，說明OsWD40基因在轉基因株系中確實過表達。比較日本晴和OsWD40過表達株系在鹽脅迫相同時間（ST0 vs NT0、ST12 vs NT12、ST24 vs NT24和ST48 vs NT48）的基因表達量，在沒有鹽脅迫時，有954個基因顯著上調，996個顯著下調；
鹽脅迫12h后有1027個基因顯著上調，619個顯著下調；
鹽脅迫24h后總差異表達基因數目顯著增加，達到3499個，其中2955個基因顯著上調，544個顯著下調；
鹽脅迫48h后有416個基因顯著上調，1061個顯著下調。鹽脅迫24h，2個株系之間的總差異基因數目最多，其中上調的基因數占到了84.45%。推測這些差異基因可能是導致2個株系耐鹽性不同的關鍵基因。
圖2 各比較組的差異表達基因數Fig.2 Number of differently expressed genes in each comparison group
韋恩圖分析（圖3）發現，有258個基因在4個鹽處理相同時間的比較組中均呈現差異表達，其中包括許多參與非生物脅迫響應的重要基因，如OsRLCK5、OsWRKY41和OsWRKY61等。蛋白激酶OsRLCK5在OsWD40過表達株系中顯著上調，其可以與谷氧還蛋白OsGRX20相互作用，參與抗壞血酸―谷胱甘肽循環系統的激活，從而調節活性氧平衡以增強水稻對非生物脅迫的抗性[15]。有136個基因在鹽脅迫12、24和48h時呈差異表達，但在沒有鹽脅迫時沒有顯著差異，這些差異表達基因包括鉀轉運蛋白（OsHAK5）、E3泛素連接酶基因（Os02g0682300）、脫落酸8′-羥化酶基因（OsABA8ox2）和根系發育調控基因（Os04g0556350）。OsHAK5屬于HAK鉀轉運蛋白家族成員，是分蘗發育、側根生長、根毛生長和生長素運輸途徑之間的匯合點。在胞外存在大量Na+的條件下，OsHAK5表現出對Na+不敏感的K+轉運蛋白活性，能夠用來提高植物細胞對鹽的耐受性[16-17]。
圖3 不同比較組間的差異表達基因韋恩圖Fig.3 Venn diagram of differently expressed genes between different comparison groups
2.4 差異表達基因的GO功能分析
對日本晴和OsWD40過表達株系在鹽脅迫相同時間（ST0 vs NT0、ST12 vs NT12、ST24 vs NT24和ST48 vs NT48）的差異基因進行GO功能富集分析。生物進程的GO功能富集分析柱狀圖結果（表3）顯示，防御響應（GO:0006952）、蛋白質磷酸化（GO:0006468）、以DNA為模板的轉錄調控（GO:0006355）、對ABA的響應（GO:0009737）、對鹽脅迫的響應（GO:0009651）和次生代謝產物的生物合成過程（GO:0044550）等條目在沒有鹽脅迫及鹽脅迫所有時間富集到的差異基因數目均較多。細胞組分富集的差異表達基因較多的條目包括核（GO:0005634）、質膜（GO:0005886）、膜的組成部分（GO:0016021）和細胞外區域（GO:0005576）等。分子功能GO分析結果表明，與蛋白結合（GO:0005515）相關的差異表達基因最多。
表3 各比較組中重要GO條目的差異表達基因數目Table 3 The number of DEGs of important GO terms in each comparison groups
顯著富集到的GO功能條目分別有178、165、225和142個（P＜0.05）。每組顯著排名前20的GO條目如圖4所示，其中細胞外區域（GO:0005576）在沒有鹽脅迫和鹽脅迫12h時顯著富集；
幾丁質酶活性（GO:0004568）在鹽脅迫12和48h時顯著富集；
氧化還原酶活性（GO:0016709）在沒有鹽脅迫及鹽脅迫12和48h時顯著富集。
圖4 差異表達基因的GO功能富集分析氣泡圖Fig.4 Bubble chart of GO enrichment analysis of differently expressed genes
2.5 差異表達基因的KEGG代謝通路分析
對日本晴和OsWD40過表達株系鹽脅迫相同時間（ST0 vs NT0、ST12 vs NT12、ST24 vs NT24和ST48 vs NT48）的差異表達基因進行KEGG富集分析，分別有609、460、1208和444個基因得到注釋（表4）。表4顯示了各比較組差異基因數目較多的重要代謝通路。這些重要的代謝通路主要有植物激素信號轉導（ko04075）、植物MAPK信號傳導途徑（ko04016）、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝（ko00270）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、苯丙烷生物合成（ko00940）、類黃酮生物合成（ko00941）和二萜類生物合成（ko00904）等。其中，分別有53、28、67和33個差異表達基因參與植物激素信號轉導的，有63、39、67和30個差異表達基因參與苯丙烷生物合成。推測這些通路在OsWD40過表達水稻根系響應鹽脅迫中發揮著重要作用。
表4 差異表達基因數較多的重要KEGG代謝通路Table 4 Important KEGG metabolic pathway with a large number of differently expressed genes
續表4 Table 4(continued)
2.6 轉錄因子相關基因分析
轉錄因子在植物對抗非生物脅迫中發揮著非常重要的作用。對各比較組的差異表達基因分析（表5）顯示，WRKY、MYB和bHLH等轉錄因子在鹽脅迫0、12、24和48h時都呈現出差異表達。鹽脅迫24h時差異表達的轉錄因子數高達68個，其中，上調55個，約占79.03%，而下調的轉錄因子僅13個，上調的轉錄因子包括13個MYB和13個bHLH家族轉錄因子。鹽脅迫48h時共有33個轉錄因子差異表達，其中8個轉錄因子上調，25個下調，下調的轉錄因子數明顯多于上調的轉錄因子數。沒有鹽脅迫和鹽脅迫12h時上調基因數與下調基因數在同一數量水平。
表5 日本晴和OsWD40過表達株系之間差異表達基因中與轉錄因子相關的基因數Table 5 Number of differently expressed genes related to transcription factors between Nipponbare and OsWD40 overexpression line
2.7 轉錄組測序數據的qRT-PCR驗證
為了驗證轉錄組測序結果的真實性，從鹽脅迫相關基因和ABA響應相關基因中挑選了6個差異表達基因[LOC_Os11g03300（OsNAC10）、LOC_Os05g39770（OsAMTR1）、LOC_Os07g47100（OsNHX1）、LOC_Os06g10880（OsbZIP46）、LOC_Os03g44380（OsNCED3）、LOC_Os05g46480（OsLED3）]，在日本晴和OsWD40過表達株系4個鹽處理時間點的根系組織中對它們的轉錄水平進行了qRT-PCR驗證分析。盡管轉錄組測序數據（表6）與qRT-PCR驗證（圖5）獲得的基因差異倍數在數值上不完全一致，但各差異表達基因的變化趨勢是一致的（R2=0.7791），這表明轉錄組測序數據較為可靠。
圖5 鹽脅迫不同時間差異表達基因的qRT-PCR分析Fig.5 qRT-PCR analysis of differently expressed genes at different hours after salt treatment
表6 各差異表達基因轉錄組測序數據Table 6 Transcriptome sequencing data of each differentially expressed genes
本研究選擇水稻根系作為試驗取材部位，采用遺傳背景差異僅在OsWD40是否過表達的日本晴和OsWD40過表達株系進行轉錄組分析，更利于解析在鹽脅迫下OsWD40引起的基因表達差異，了解OsWD40基因在水稻根系耐鹽中的分子機制。
植物激素，尤其是ABA，在植物非生物脅迫響應中起著至關重要的作用[18]，還能介導植物對一些逆境脅迫的生理反應，如鹽脅迫導致的氣孔關閉，以增加植物的抗逆性等，并通過脅迫信號轉導以控制基因表達[19]。OsPYL/RCAR5是水稻中有功能的ABA受體，調控依賴ABA的相關基因的表達，在種子萌發和幼苗生長過程中正向調節ABA信號傳導，也是非生物脅迫應激基因表達的正向調控因子[20]。編碼bZIP轉錄因子的基因OsABI5在水稻幼苗中可被ABA和高鹽誘導表達，在水稻中過量表達OsABI5后對鹽脅迫高度敏感，抑制OsABI5的表達而提高了水稻的抗逆性[21]。本研究通過對日本晴和OsWD40過表達株系在鹽脅迫相同時間的根系差異表達基因的GO富集分析發現，4個比較組在對鹽脅迫的響應（GO:0009651）和對ABA的響應（GO:0009737）的GO條目中富集到的差異表達基因數目均較多。對ABA的響應分別富集到了19、20、33和20個差異表達基因，對鹽脅迫的響應分別富集到了22、6、41和14個差異表達基因。另外，4個比較組富集到植物激素信號轉導（ko04075）和植物MAPK信號傳導途徑（ko04016），這2條KEGG代謝通路的差異基因也很多，這些差異基因包括OsPYL2和OsABI5。OsABI5在日本晴和OsWD40過表達株系中均上調表達，但是在OsWD40過表達株系中的上調幅度顯著小于日本晴。結合OsWD40啟動子中包含多個響應ABA脅迫的作用元件，我們可以推測，在水稻受到鹽脅迫時，OsWD40會介導根系中多個響應ABA的基因差異表達，進一步影響下游鹽脅迫相關基因表達，從而提高水稻的耐鹽性。
次生代謝產物是植物為了適應逆境所產生的特異物質，是植物長期與環境共存并不斷適應的結果，在植物適應生態環境的過程中充當著重要的角色，促進植物適應環境脅迫[22]。苯丙烷生物合成是植物次生代謝十分重要的途徑之一，也是產生黃酮類化合物、香豆素和木質素等許多其他重要化合物的起點。黃酮類化合物在穩定細胞結構以及維持細胞膜的流動性中起到了重要作用[23]。本研究通過對日本晴和OsWD40過表達株系在鹽脅迫相同時間的根系差異表達基因進行KEGG代謝通路分析，發現苯丙烷生物合成（ko00940）通路在4個比較組中都顯著富集，分別有63、39、67和30個差異表達基因。另外，有19、18、31和14個差異表達基因參與類黃酮生物合成（ko00941）。4-香豆酸:輔酶A連接酶（Os4CL1）是單木質醇類和黃酮類生物合成中苯丙素代謝途徑中的一個關鍵酶[24]，在鹽脅迫0和48h時都檢測到該基因在日本晴和OsWD40過表達株系之間差異表達。過氧化物酶基因OsPOX1參與苯丙烷生物合成，與日本晴相比，該基因在OsWD40過表達株系中顯著上調表達，其余差異表達基因有很大一部分被推定編碼過氧化物酶前體。過氧化物酶前體可以形成過氧化物酶體，過氧化物酶體是高度動態、代謝活躍的細胞器，主要參與脂肪酸等脂質的代謝及產生和清除不同的活性氧，從而提高植物對非生物環境的適應性[25]。這些結果說明苯丙烷生物合成和類黃酮生物合成等植物次生代謝途徑參與了OsWD40基因介導的水稻根系耐鹽性。
眾所周知，轉錄因子在脅迫信號轉導等方面起著至關重要的作用。目前已經鑒定的與耐鹽有關的轉錄因子家族有WRKY、MYB、NAC、bHLH和AP2/ERF等[26]。WRKY家族轉錄因子不僅在調節植物對非生物和生物脅迫的反應中有著密切的聯系，還能調節根系發育[27]。在擬南芥中過表達OsWRKY42的植株具有更高水平的花青素含量，并顯示出對鹽脅迫的強耐受性[28]。Zhao等[29]發現了一條新的信號途徑，MYB轉錄因子可直接與ABA受體PYL8直接相互作用，干擾ABA與生長素信號之間的網絡，從而促進側根的生長恢復。過表達OsMYB3R的擬南芥轉基因植物增加的了對冷、干旱和鹽脅迫的耐受性，同時在種子萌發時，轉基因植株比野生型對ABA或NaCl具有更高的耐受性[30]。SNAC1基因是從水稻中鑒定的轉錄因子NAC超家族，在250mmol/L NaCl條件下，過表達SNAC1的棉株比野生型植株生長更旺盛，尤其是在根系發育方面，證明SNAC1通過增強根系發育來提高棉花對鹽的耐受性[31]。bHLH家族轉錄因子在激素處理下可以適當的速率維持根系細胞的伸長[32]。OsbHLH120（qRT9）通過改善田間條件下的根部厚度和根長來增強水稻對非生物脅迫的防御能力[33]。Cao等[34]發現，OsBIERF1、OsBIERF3 和 OsBIERF4受鹽、冷和干旱脅迫而上調，OsBIERF蛋白可能參與對不同非生物脅迫響應的信號傳導途徑。在本研究中，有大量轉錄因子在各比較組中差異表達，并且與日本晴相比，大部分轉錄因子在OsWD40過表達株系中是上調表達的，鹽脅迫0、12、24和48h時分別有27、18、55和8個轉錄因子家族基因上調表達。鹽脅迫24h時有55個轉錄因子上調表達，僅13個下調表達，上調的轉錄因子包括6個WRKY轉錄因子（OsWRKY29等）、13個MYB轉錄因子（OsMYB106等）、13個bHLH轉錄因子（OsbHLH120等）和6個AP2/ERF轉錄因子（OsBIERF1等）。這些結果表明，OsWD40可能引起大量轉錄因子的差異表達，并在根系響應鹽脅迫過程中發揮重要作用。
本研究對日本晴和OsWD40過表達水稻在鹽脅迫下的差異表達基因進行分析，在轉錄組水平上解析了OsWD40可能引起的水稻根系耐鹽的分子機制。OsWD40作為WD40重復蛋白家族的一員，在鹽脅迫下引起苯丙烷生物合成及類黃酮生物合成等植物次生代謝途徑的改變，同時介導響應ABA的基因轉錄調控，從而激活下游鹽脅迫相關基因的表達。這為進一步挖掘耐鹽關鍵基因和培育耐鹽水稻新品種奠定了理論基礎。
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