候舒文，陳 薇，嚴雅蘭，劉 慧，袁 靜
安徽醫科大學第一附屬醫院產前診斷中心，安徽合肥 230022
由染色體數目或者結構異常引起的一類遺傳性疾病被稱為染色體病，其可以導致新生兒出生缺陷[1]。自從1966年有研究者首次培養羊水細胞成功并用于產前診斷后,該技術已成為一種減少新生兒出生缺陷的重要手段[2-3]。1984年TABOR等[4]首次報道了羊水細胞載玻片-原位培養法(以下簡稱原位法)，該方法是將羊水細胞直接接種到載破片上進行培養。而目前各實驗室普遍應用的方法是羊水細胞胰酶消化法，即將羊水細胞接種到培養瓶上進行培養。本實驗室原先以胰酶消化法培養羊水細胞，從2020年開始同時采取胰酶消化法和原位法進行平行培養羊水細胞并進一步進行染色體核型分析。為探討兩種羊水細胞培養方法在產前診斷中的臨床意義及比較兩種不同的方法對羊水細胞培養、收獲、制片及染色體核型分析的效果，現對兩種方法的羊水細胞培養成功率、培養時間、分裂相、染色體核型結果等進行比較分析，現報道如下。
1.1一般資料 選取2020年7—12月在安徽醫科大學第一附屬醫院進行產前診斷的1 105例孕婦羊水標本作為研究對象，年齡17～47歲，孕周18～24周。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，并與所有受檢者簽訂知情同意書。1 105例孕婦羊水產前診斷指征包括高齡(324例)、唐氏篩查高風險(258例)、B超異常(159例)、不良妊娠史(168例)、夫婦之一染色體異常(38例)、無創產前基因檢測高風險(60例)、其他(98例)。
1.2儀器與試劑
1.2.1儀器 超凈工作臺SW-CJ-1F(蘇州凈化)、二氧化碳培養箱HERAcell240i(美國Thermo)、倒置顯微鏡TS2 Fi3(日本Nikon)、大容量低速離心機KDC-1044L(安徽中科中佳)、電熱恒溫水槽DK-B600型(上海三發)、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進)、電熱恒溫培養箱DNP-9082BS-Ⅲ(上海新苗)、冰箱BCD-192WE(青島Hisense)、醫用低溫保存箱DW-25W518(青島Haier)、染色體分散儀CDS-5(美國THERMOTRON)、GSL-120 全自動染色體核型掃描分析系統(美國Leica)。
1.2.2試劑 羊水細胞培養基(廣州達暉)、細胞原位培養盒(杭州杰毅麥特)、細胞培養瓶(美國FALCON)、秋水仙素(杭州寶榮)、氯化鉀(上海瀘試國藥)、枸櫞酸鈉(上海瀘試國藥)、乙二胺四乙酸(上海生工)、胰酶(美國Sigma)、甲醇(無錫展云)、冰乙酸(無錫展云)、胰酶分帶液(杭州寶榮)、Giemsa染液(杭州寶榮)、其他試劑均為國產分析純。
1.3方法
1.3.1標本抽取 在無菌條件下抽取孕18～24周羊水20 mL，分別注入兩個15 mL無菌離心管內備用。
1.3.2接種 兩管羊水轉速以2 000 r/min離心7 min，棄上清，一管羊水加入培養基4 mL，吹打混勻后，接種至培養瓶中；
另一管羊水加入2 mL相同羊水培養基，輕吹混勻，吸取懸液分別接種至2個原位培養盒，移至37 ℃、5% CO2培養箱進行培養。原位培養20～48 h后，向培養盒中加入3 mL新鮮羊水培養基，繼續培養。
1.3.3換液 (1)胰酶消化法：培養9～11 d后于顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞貼壁生長并且有多個較好的梭形細胞克隆形成時，將原培養液移入另一培養瓶中繼續培養以備用，向原培養瓶中加入4 mL新鮮培養基繼續培養24 h。(2)原位法：培養6～8 d后于顯微鏡下觀察細胞生長情況。克隆較多，且多為中大克隆時即可換上3 mL新鮮培養基繼續培養24 h。
1.3.4收獲 (1)胰酶消化法：用注射器(7號針頭)向培養瓶內加入濃度為20 μg/mL的秋水仙素2滴，于37 ℃恒溫培養箱中處理2.5 h后，采用胰酶消化法(0.25%消化胰酶)收集羊水細胞，再加入37 ℃預熱的低滲液(0.075 mol/L KCl)6 mL，吹打混勻后低滲5 min，然后依次進行預固定、固定處理制得細胞懸液后，進行滴片、烤片、G顯帶制備染色體。(2)原位法：向培養盒內加入100 μg/mL秋水仙素50 μL，于二氧化碳培養箱內繼續培養30 min，吸去培養液，再加入37 ℃預熱后的低滲液(0.4% KCl,0.4%枸櫞酸鈉=1∶1)低滲30 min，依次進行預固定、第一次固定、第二次固定、第三次固定處理后，將培養盒內的玻片平放在染色體分散儀中進行分散，然后再烤片、G顯帶制備染色體。
1.3.5閱片分析 G顯帶后，采用德國徠卡(Leica)GSL-120 全自動染色體核型掃描分析系統進行掃描、捕獲核型。根據中華人民共和國衛生行業標準(WS 322.2-2010)分析染色體核型，計數分析的細胞應來自兩個獨立的細胞培養系統，染色體顯帶分辨率至少應達到320條帶水平，原瓶消化法計數至少20個細胞，分析5個細胞，染色體核型分析2個細胞；
原位培養法計數至少15個克隆，分析5個細胞，染色體核型分析2個細胞。如遇到異常核型，應該增加計數分析染色體核型數量。
1.3.6染色體核型質量等級評分 根據文獻[5]標準，染色體核型質量采取等級進行評分。染色體核型在1 000倍放大下，分為分散(一個視野下不包含全部染色體核型)、優質(一個視野下包含全部染色體核型且染色體核型交叉少于或等于5條)、差(染色體核型交叉大于5條)3個等級。
1.4統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行統計分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對計量資料進行正態分布檢驗。非正態分布以M(25，P75)表示。組間比較采取Mann-WhitneyU檢驗(非正態分布計量變量)。計數資料用率(%)表示，組間比較采取配對設計χ2檢驗。P<0.05 表示差異有統計學意義。
2.1原位法與胰酶消化法羊水細胞培養成功率比較 1 105例羊水標本均采用原位法、胰酶消化法兩種培養方法進行雙線培養及制片，其中2例羊水樣本兩種方法均培養失敗，這2例樣本有陳舊性出血，離心后有少許褐色沉淀；
1例樣本性狀為茶色、顏色渾濁，原位法培養失敗，胰酶消化法培養成功；
2例樣本胰酶消化法培養失敗，原位法培養成功，其中1例羊水性狀呈醬油色，1例呈褐色。胰酶消化法培養成功率為99.64%(1 101/1 105)，原位法培養成功率為99.73%(1 102/1 105)，這兩種方法的培養成功率比較，差異無統計學意義(χ2=0.33，P>0.05)。
2.2原位法與胰酶消化法羊水細胞培養條件及分裂相比較 原位法羊水需求量為5 mL，培養基用量為7 mL；
胰酶消化法羊水需求量為10 mL，培養基用量為8 mL。與胰酶消化法相比，原位法羊水細胞培養時間短，分裂相及優質分裂相數目多，差異均有統計學意義(Z=-31.83，P<0.001;Z=-2.937，P=0.003;Z=-2.943，P=0.003)。見表1。原位法每張玻片獲得的染色體核型數目多于胰酶消化法，且其核型完整度、染色體分散度、顯帶清晰度都要優于胰酶消化法。見圖1、2。
表1 原位法與胰酶消化法羊水細胞培養條件及分裂相數目比較
注：A為原位法的顯微鏡下染色體核型(×10)；
B為胰酶消化法的顯微鏡下染色體核型(×10)。
注：A為原位法的1 000倍放大下染色體核型；
B為胰酶消化法的1 000倍放大下染色體核型。
2.3原位法與胰酶消化法羊水染色體核型結果比對與分析
2.3.1羊水染色體核型結果比對分析 實行胰酶消化法、原位法兩種方法雙線培養均成功的羊水標本為1 100例，其中兩種方法均檢出972例正常核型(88.36%)、128例異常核型(11.64%)，染色體核型結果符合率為100%。128例異常核型包括3例13三體(0.27%)、3例18三體(0.27%)、16例21三體(1.45%)、3例47,XXX(0.27%)、3例47,XXY(0.27%)、1例49,XXXXY(0.09%)、1例69,XYY(0.09%)、12例易位(1.09%)、23例倒位(2.09%)、3例缺失(0.27%)、1例重復(0.09%)、52例染色體多態性改變(4.73%)、7例染色體數目異常真嵌合(0.64%)。見表2。
表2 1 100例羊水染色體核型結果符合率比對分析(n)
2.3.2染色體核型嵌合 在雙線培養的原位法發現了8例染色體異常嵌合，其中7例嵌合的異常核型均出現在原位法兩線培養玻片上的數個克隆內，并且在單線培養的胰酶消化法中也發現這7例染色體異常嵌合，則判斷此為真嵌合，7例核型異常真嵌合結果見表3；
還有1例僅在原位法1線培養的8號克隆內發生1號染色體部分片段易位，其他克隆內的核型均未出現易位，判斷此為假嵌合現象。
表3 7例羊水染色體核型嵌合結果
新生兒出生缺陷的重要原因是染色體病，而確診染色體病的主要方法是羊水細胞培養及染色體核型分析技術。目前隨著分子生物學技術的發展，不斷涌現許多新的遺傳診斷技術，而染色體核型分析仍是診斷染色體異常的金標準，因為其對易位、倒位、嵌合等染色體異常的檢出具有無可替代的重要作用。羊水多來源于外、中、內三個胚層的脫落細胞，活細胞少，培養難度高[6]。本實驗室原先采用的是傳統的羊水細胞培養瓶-胰酶消化培養法，該法操作步驟繁瑣、細胞丟失多、核型清晰度不佳，且由于采用胰酶消化將細胞克隆混合而無法區分細胞來源[7]，之后本實驗室為提高染色體核型質量及產前診斷的準確率而引入羊水細胞載玻片-原位培養法。
本研究同時采取胰酶消化法和原位法培養羊水細胞，配對設計χ2檢驗分析兩種方法的培養成功率，差異無統計學意義(P>0.05)，與郝娜等[7]報道結果一致。原位法使用的載玻片是具有天然正電荷的玻璃材質，羊水細胞更容易在其表面貼壁生長[8]，縮短了培養時間，且其接種面積較胰酶消化法小，培養基用量更少，與胰酶消化法相比，原位法既縮短了產前診斷報告發放時間又節省了羊水培養基用量。本研究對進行產前診斷的孕婦抽取20 mL羊水進行染色體核型分析，10 mL羊水接種于培養瓶中，另10 mL羊水平均分成兩份5 mL分別接種于兩個原位培養盒中。在原位法的羊水接種量僅為5 mL的情況下，其核型分裂相仍多于胰酶消化法。本研究采取GSL-120 全自動染色體核型掃描分析系統進行掃描、捕獲核型，根據染色體核型交叉條數及在1 000倍放大的視野下是否包含全部染色體來評判染色體分散質量[5]，結果顯示原位法培養的羊水中優質分裂相也多于胰酶消化法。可能由于原位法直接將羊水接種于載玻片上，樣本無需進行多次轉移、胰酶消化及多次離心吹打、滴片等步驟，相較于胰酶消化法簡化了實驗操作步驟，減少了細胞損失及實驗操作錯誤的發生，實現了羊水細胞標準流程化操作，從而可以獲得更多、更滿意的染色體核型以供分析。
本研究對原位法與胰酶消化法同時培養成功的1 100例羊水染色體核型結果進行比對與分析，結果顯示兩種方法培養的羊水染色體核型結果符合率為100%，均檢出972例正常核型、128例異常核型，其中包括7例染色體數目異常真嵌合。嵌合體是指同一個體內同時存在兩種或兩種以上的細胞系[9]，在閱片過程中能夠準確鑒別真假嵌合體，對臨床預后的選擇具有至關重要的作用。國外學者主張根據嵌合體性質將嵌合體分為3種水平[10]：水平Ⅰ是指單個異常核型僅出現在單個培養體系中，一般判斷為假嵌合；
水平Ⅱ是指兩個或兩個以上相同異常核型僅出現在單個培養體系中；
水平Ⅲ是指兩個或兩個以上相同異常核型出現在兩個或兩個以上的培養體系中，一般為真嵌合的可能性高。對于水平Ⅱ嵌合體胰酶消化法很難鑒別，因為胰酶消化法采用胰酶消化將細胞克隆混合而無法有效辨別真假嵌合；
原位法則保留了羊水細胞克隆性，可以有效區分真假嵌合。在原位法的羊水染色體核型分析過程中若發現兩個或兩個以上的相同異常核型僅出現在單個克隆內時，則認為此是假嵌合[11]。在實驗過程中造成假嵌合的原因可能為羊水細胞在體外培養的環境與體內不同而發生的異常突變、母體細胞在羊膜腔穿刺時混入導致其與羊水細胞同時增殖、胰酶消化法制片過程中由于胰酶消化、刮取細胞等操作導致的染色體斷裂、易位等[12-15]。與胰酶消化法相比，原位法保留了羊水細胞克隆性，可以鑒別羊水細胞來源，分辨染色體真假嵌合，降低了假性嵌合風險，有利于產前診斷的嵌合體異常診斷[16]。
綜上所述，原位法具有培養時間短、培養基用量少、羊水需求量少、操作步驟簡單、優質分裂相多,以及可以有效診斷真假嵌合等優點，實現了羊水細胞標準流程化操作，提高了染色體核型質量，縮短了產前診斷報告發放時間。但原位法耗材成本高且制片的可重復性低；
胰酶消化法則由于可以重復滴片其制片的可重復性相對較高，且耗材相對經濟。結合原位法和胰酶消化法的優缺點，羊水細胞培養可以采用原位法為主、胰酶消化法為輔的培養模式，提高產前診斷的效率、準確率與成功率。