陳百順，夏 榮，余金蘭
目前臨床上治療牙體缺損的最常用方法是樹脂粘接術，然而大量的實驗室和臨床證據表明，樹脂粘接術的長期療效不佳，出現充填體著色、微滲漏繼發齲和充填體脫落。牙本質主要由無機礦物質羥基磷灰石(HA)和有機質Ⅰ型膠原纖維(占有機物的90%)組成[1]，牙本質膠原纖維的再礦化為解決粘接界面的問題提供了一種新的途徑。除了牙體缺損，牙本質敏感癥也是臨床上常見的口腔疾病，其主要是由于牙釉質缺損，牙本質暴露，當牙齒受到外界刺激時會產生短暫而尖銳的疼痛[2]，封閉牙本質小管阻斷此過程將會是治療牙本質過敏癥的有效方法，牙本質膠原纖維的再礦化也為其提供了新的治療方法[3]。目前牙本質膠原纖維礦化過程需要幾周至幾個月，這大大限制了這項技術應用于臨床。該研究基于已有的膠原纖維礦化方法，使用Er,Cr:YSGG激光輔助，觀察對礦化時間的影響，為這項技術應用于臨床提供新的思路。
1.1 實驗材料人類健康第三恒磨牙由安徽醫科大學第二附屬醫院口腔科提供(經安徽醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準)。
1.2 主要試劑氯化鈣(CaCl2)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、聚天冬氨酸(polyaspartic acid，PASP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、疊氮鈉(NaN3)、胃蛋白酶均購自上海索萊寶生物科技有限公司。
1.3 主要儀器Sartorius電子天平(BSA124S，德國賽多利斯科學儀器有限公司)，GeminiSEM500掃描電子顯微鏡(德國卡爾 ·蔡司公司)，恒溫磁力攪拌儀(JB-2010，金壇市杰瑞爾電器有限公司)，KH-100DB超聲波清洗儀(江蘇昆山禾創儀器公司)，pH測試儀(TP110，北京時代新維測控設備有限公司，經)，Er，Cr：YSGG激光(美國Biolase公司)，CPD300CO2臨界點干燥儀(德國徠卡儀器有限公司)，UNHT納米壓痕儀(奧地利安東帕有限公司)。
1.4 實驗方法
1.4.2制備脫礦標本 稱取EDTA(相對分子質量292.24)，加入去離子水中，NaOH調節pH至8.0，制備出0.5 mol/L(pH=8)的脫礦液，將牙本質切片浸泡其中30 min，取出后用無菌生理鹽水反復沖洗，胃蛋白酶消化。將0.05%(w/v)胃蛋白酶溶于0.5 mol/L乙酸溶液制成消化液，將牙本質切片放入消化液中37 ℃消化48 h，去離子水清洗，5.25%次氯酸鈉消毒，生理鹽水沖洗，置于無菌生理鹽水中4 ℃保存，加入NaN3防止細菌滋生。
1.4.3制備礦化液 取無水CaCl2配制500 ml 20 mmol/L的鈣離子溶液，加入0.8 mg PASP；
取Na2HPO4配制出500 ml 12 mmol/L的含磷溶液；
向磷溶液中緩慢滴定鈣溶液，磁力攪拌器37 ℃恒溫勻速攪拌，防止沉淀，滴定完成后，Tris調節pH值至6.5～7.0，濾膜過濾，得到鈣離子濃度為10 mmol/L，磷離子濃度為6 mmol/L礦化溶液，加入NaN3防止細菌滋生，密封儲存。
1.4.4使用來自同一個牙齒的牙本質切片分組 實驗組A：使用來自同一顆牙齒的牙本質切片，浸泡于礦化液中10 min，不使用Er,Cr:YSGG照射。實驗組B：構造一個激光輔助礦化的裝置，將牙本質切片置于礦化液中，浸沒于水面下約1 mm，Er,Cr:YSGG使用硬組織模式，MZ4光纖頭，垂直于牙本質切片照射1 min，冷卻1 min，更換新的礦化液，繼續此過程，一共照射5次，激光處理與冷卻浸泡共計處理10 min。空白對照組C：脫礦的牙本質標本。預實驗組D：使用來自同一顆牙齒的牙本質切片，將牙本質切片置于生理鹽水，浸沒于水面下約1 mm，Er,Cr:YSGG使用硬組織模式，MZ4光纖頭，垂直于牙本質切片照射1 min，冷卻1 min，更換新的生理鹽水，繼續此過程，一共照射5次，激光處理與冷卻浸泡共計處理10 min。
1.4.5SEM電鏡檢測與EDSX射線能譜分析 牙本質切片用電鏡固定液固定2 h，去離子水反復沖洗，梯度乙醇溶液處理，結束后使用 CO2臨界點干燥儀干燥。將干燥后的標本密封保存。選取幾組標本，利用液氮使其脆斷后獲取縱剖的牙本質切片標本，挑選出橫截面與縱剖面比較平緩無明顯高低落差的標本，真空噴金。
1.4.6維氏顯微硬度檢測牙本質標本表面顯微硬度 來源于同一顆牙齒的標本選取2個，其中一個在脫礦實驗后直接進行硬度測試，其作為對照組，結果記為H0，另一個樣本進行不同方法處理(直接使用礦化液處理，使用Er,Cr:YSGG激光+礦化液處理)后進行硬度測試，結果記為H1，從實驗組A與實驗組B中分別隨機選取10個樣本，使用納米壓痕儀進行硬度測量，每個樣本上選取9個點測量硬度值，最后以這9個數值的平均值作為此樣本的最終硬度。
2.1 不同處理方法的牙本質標本表面的SEM檢測結果SEM檢測結果顯示：空白對照組C，脫礦后的牙本質羥基磷灰石晶體消失，膠原纖維網暴露(圖1A)；
實驗組D，Er,Cr:YSGG+生理鹽水處理(圖1B)，與未經任何處理的脫礦牙本質空白對照組相比，無明顯變化，牙本質小管空虛，無新礦物質生成，與脫礦后的牙本質標本無明顯差異，表明Er,Cr:YSGG處理未對實驗標本產生影響；
實驗組A，僅礦化液處理相同時間(圖1C)，牙本質小管無明顯變化，膠原纖維暴露，未見新的礦物質沉積；
實驗組B，Er,Cr:YSGG+礦化液處理(圖1D)，可見牙本質小管內有新的物質沉積，覆蓋于膠原纖維上，小管直徑縮小；
通過掃描電鏡放大3 000倍觀察實驗組B，Er,Cr:YSGG+礦化液處理(圖1E)可以發現視野內的大部分牙本質小管內均有新礦物質生成；
通過掃描電鏡放大3 000倍觀察Er,Cr:YSGG+生理鹽水組(圖1F)，與激光礦化液組相比，小管內空虛，可見膠原纖維痕跡。
圖1 牙本質標本表面的SEM圖
2.2 不同處理方法的牙本質標本縱剖面的SEM檢測結果僅礦化液處理，牙本質小管開放，小管內干凈通透，膠原纖維網暴露，無其他物質沉積(圖2A)；
Er,Cr:YSGG+礦化液處理后的牙本質標本縱剖面，SEM檢測可見小管內有新的物質沉積，部分堵塞牙本質小管，小管直徑縮小，沉積物集中于靠近牙本質表面，小管深處未見明顯礦物質生成，可能由于Er,Cr:YSGG激光滲透深度有限，未能有效滲透深層牙本質(圖2B)。
2.3 不同處理方法的牙本質標本X射線能譜分析結果僅礦化液處理，牙本質標本表面羥基磷灰石晶體去除，主要為膠原纖維，表面鈣磷元素均勻分布，牙本質小管與牙本質表面無明顯差異(圖3A、3C)；
Er,Cr:YSGG+礦化液處理后的標本，鈣磷元素大量沉積于牙本質小管，鈣磷元素遠多于實驗組A，表明經Er,Cr:YSGG+礦化液處理后，有新的礦物質沉積，小管內鈣磷元素濃度遠大于牙本質表面，相比較于牙本質表面，小管內富集更多鈣磷元素，小管內形成更多的礦物質沉積(圖3B、3D)。
圖2 牙本質標本縱剖面的SEM圖
圖3 牙本質標本的X射線能譜圖 ×3000
2.4 維氏硬度測試結果及統計學分析實驗結果數據統計采用配對樣本t檢驗，比較組A、C,差異無統計學意義(t=1.234，P=0.248)，表明僅礦化液處理前后，樣本無明顯硬度變化。比較實驗組B、C，差異有統計學意義(t=3.361，P<0.000 1)，表明Er,Cr:YSGG激光+礦化液處理后，樣本硬度明顯增加，提示樣本上有新的礦物質生成，脫礦牙本質產生了再礦化。對實驗組A、B中的H0數值進行獨立樣本的t檢驗，差異無統計學意義(t=0.645，P=0.527)，表明實驗組A、B間的H0樣本沒有差異，即實驗組的標本間沒有差異。對實驗組A、B中的H1-H0數值進行獨立樣本的t檢驗，差異有統計學意義(t=11.645，P<0.000 1)，表明相較于僅礦化液處理，Er,Cr:YSGG激光+礦化液處理后的牙本質標本硬度顯著增加(表1)。
表1 各組實驗前后牙本質表面顯微硬度
牙本質由70%礦物質羥基磷灰石、20%有機物和10%的水組成[4]，牙本質的仿生礦化可以使脫礦的牙本質再礦化[5]，是治療牙本質過敏癥的可行方法，通過再礦化在膠原纖維上沉積新的礦物晶體，封閉牙本質小管從而治療牙本質過敏癥[6]，同時，仿生礦化可以使粘接修復術中未能與樹脂完全結合而暴露的膠原纖維繼續礦化，為治療微滲漏，提高樹脂粘接術的成功率和延長遠期療效提供了一種新的治療方法，目前牙本質的仿生礦化多局限于實驗室試驗階段，常見的仿生礦化周期較長，需要幾周至數月，這大大局限了仿生礦化的治療方法應用于臨床治療，也有實驗通過電場輔助將次過程縮短至幾個小時[7]。
已有學者實驗通過激光照射，輔助人類牙釉質的類釉質再生，利用激光的能量，在礦化溶液中，加速磷灰石晶體的生成，沉積于人類牙釉質上[8-9]。
目前普遍認為，Ⅰ型膠原和非膠原蛋白及其類似物是參與礦化的最主要成分[10]，研究表明單獨膠原本身無法誘導羥基磷灰石晶體的形成，但是它的結構可以作為礦物質的支架并指導羥基磷灰石晶體的自組裝和生長，為了建立脫礦膠原纖維的模型，本實驗選用人類健康第三磨牙，除去牙釉質及牙骨質剩下牙本質，再脫礦除去羥基磷灰石晶體，建立膠原纖維模型，酸蝕法是目前最常用的脫礦方法，使用不同濃度的磷酸處理不同的時間均可以達到脫礦目的，EDTA不同于先前使用的酸蝕劑，例如甲酸/甲酸鈉，磷酸和鹽酸， EDTA通常被認為是有效的金屬陽離子螯合劑，其能夠通過絡合溶解牙/骨中的礦物質，同時保持膠原蛋白結構基本完好無損[11]。有實驗表明，即使骨在EDTA中浸泡超過一個月時膠原纖維結構不會發生改變。因此，本實驗采用EDTA脫礦，避免了酸蝕可能使膠原蛋白基質結構發生改變。
基于經典成核理論，成核速率通常與兩個函數有關，J ∝ exp(-EA/KBT) exp(-ΔGex/KBT) ，第一個函數與能量EA有關(KB：Boltzmann常數，T：絕對溫度)，第二個函數相關于熱力學屏障ΔGex，ΔGex = Bα3σ-2，其中B是與成核物質相關的恒定常數，α是界面自由能，σ是過飽和。基于函數一，溫度可以顯著改變成核速率[9]，本實驗采用Er,Cr:YSGG(一種已廣泛應用于牙科治療的激光)，Er,Cr:YSGG激光波長2 780 nm，與水和羥基磷灰石晶體的吸收峰相匹配[12]，水與羥基磷灰石晶體可以更好地吸收激光的能量，加快成核的速率。基于函數二，溶液的過飽和程度也會對成核產生影響，本實驗配置了過飽和的鈣磷溶液，用于礦化過程。本實驗采用聚天冬氨酸(poly aspartic acid，PASP)作為非膠原蛋白(non-collagen proteins，NCPs)類似物，PASP已被證明是一種優秀的可用于膠原纖維礦化的NCPs類似物[13-14]。
本實驗結果表明，相比于自然礦化，引入Er,Cr:YSGG激光輔助，可以加快礦化過程，在相同時間內，自然礦化組無明顯新礦物質生成，而Er,Cr:YSGG激光輔助處理后，牙本質小管內有明顯的新礦物質生成，覆蓋于小管內壁，小管直徑縮小，表明與自然礦化相比，在相同時間內，Er,Cr:YSGG激光輔助膠原纖維礦化可以形成更多的鈣磷礦物質沉積并縮小牙本質小管直徑，為臨床治療過程中樹脂粘接修復術暴露膠原纖維的再礦化與治療牙本質過敏癥提供了一種新的可能。本研究結果新形成的礦物質未能將牙本質小管完全封閉，可能原因是激光處理時間尚短，未能形成足夠的礦物質沉積。下一步將改變不同激光參數、照射時間，以及選用不同激光、不同NCPs類似物繼續研究，期望可以探索出更為有效的治療方法，使此項治療方法早日應用于臨床治療。
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