陳帥 袁崇均,* 羅森 張磊 湯依娜 袁明銘 竹敏 王笳
(1 四川省中醫藥科學院，成都 610041；
2 成都中醫藥大學附屬生殖婦幼醫院，成都 610041)
川射干為鳶尾科植物鳶尾(Iris tectorumMaxim.)的干燥根莖，具有清熱解毒、祛痰、利咽之功效，用于熱毒痰火郁結證，如咽喉腫痛、痰濁壅盛、咳嗽氣喘者[1]，其主要藥效成分為異黃酮類物質[2-3]，而鳶尾黃素就是其中的主要有效成分。鳶尾黃素又名射干苷元，5,7,4"-三羥基-6-甲氧基異黃酮，現代研究表明鳶尾黃素具有C6-C3-C6母核結構，也有α、β核不飽和吡喃酮以及C7-OH、C4"-OH等活性中心存在，具有清除自由基、抗脂質過氧化損傷和降低血糖，防止動脈粥樣硬化以及防止血管內皮細胞損傷作用，亦有對心肌梗死小鼠心臟有保護作用，還有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、雌激素類作用 等[4-7]。由于鳶尾黃素水溶性和脂溶性較差，腸道吸收較少和C-5、C-7位羥基在體內易被糖基化的原因，使活性顯著降低，因此對鳶尾黃素進行結構修飾，對于獲得高效、低毒的新型抗病毒候選藥物具有重要意義。
本研究基于鳶尾黃素的抗病毒作用，以鳶尾黃素為先導化合物[8]，采用甲氧基或者乙氧基取代C-7位的羥基，采用磺酸基取代了C-5"的氫，得到3個鳶尾黃素衍生物，分別為鳶尾黃素-5"-磺酸鈉、4",7-二乙基鳶尾黃素、4",7-二乙基鳶尾黃素-5"-磺酸鈉，顯著的改善了化合物的水溶性或脂溶性。本合成工藝操作簡單、收率高、適用于工業化大生產，路線見圖1。并采用細胞培養法[9]實驗，考察其衍生物的抗流感病毒[10]、腺病毒[11]、呼吸道合胞病毒[12]和柯薩奇病毒[13-14]作用，初步探討其藥理作用，以期開發新型抗病毒的單體成分藥物。
圖1 化合物的合成路線Fig.1 The synthetic route of the compound
1.1 試驗藥物
鳶尾黃素(陜西綠清生物工程有限公司，含量：98.86%，批號：20200502)；
鳶尾黃素-5"-磺酸鈉、4",7-二乙基鳶尾黃素、4",7-二乙基鳶尾黃素-5"-磺酸鈉，含量均≥98%，本實驗室自制，批號分別為：20200503、20200702和20200601，試驗前用生理鹽水配制成所需濃度的液體備用；
利巴韋林注射液(成都平原藥業有限公司)，規格為1 mL×10只，批準文號：國藥準字H20043330，生產批號：190801。
1.2 細胞與病毒
HeLa細胞株(衛生部藥品與生物制品檢定所)；
流感病毒(甲型H3N2病毒毒株)；
腺病毒(ADV3病毒毒株)；
呼吸道合胞病毒(RSV病毒毒株)；
柯薩奇病毒(CVB3病毒毒株)，由四川省人民醫院病毒室提供。
1.3 試劑
氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、硫酸二乙酯、濃硫酸和氯化鈉(成都市科龍化工試劑廠，分析純，批號分別為2020120401、2020010111、2020010201、2020080912、2020120304、2020020301)；
RPMI-1640培養基(GibcoBRL公司，批號1865063)；
噻唑藍(Sigma公司，批號C0009)。
1.4 儀器
RRLC-6410液質聯用儀(Agilent公司)；
AVⅡ核磁共振波譜儀(Bruker公司)；
UV-2401PC紫外分光光度儀(Shimadzu公司)；
FTIR8300紅外檢測儀(Shimadzu公司)；
WRS-2微機熔點測定儀(上海易測儀器設備有限公司)；
CPA225D電子天平型號(賽多利斯公司)；
超純水系統(Millipore公司)；
MCO-15AC CO2培養箱(三洋公司)；
細胞培養瓶和96孔細胞培養板(Corning公司)；
XDS-1B生物倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；
CKX41倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；
酶聯免疫檢測儀(Thermo Fisher公司)；
微量移液器(GILSON公司)。
2.1 化合物的制備
2.1.1 合成路線1
取鳶尾黃素500 g，加2000 mL硫酸，攪拌溶解，反應2 h，傾入20 L NaCl飽和溶液中，邊加邊攪拌，析出沉淀，放置過夜，過濾，沉淀用水煮沸溶解，趁熱過濾，放置，析晶，過濾，重結晶一次，過濾，60℃減壓干燥，得化合物1(600 g，含量＞98%，收率為89.55%)。取化合物1 200 g，加NaOH 40 g，混勻，加95%乙醇600 mL于4 L圓底燒瓶中，于水浴中加熱沸騰5 min，再加400 mL硫酸二乙酯，反應30 min，取出，立即用鹽酸調pH至2～5，加水攪拌放冷。過濾，得淡黃色粉末，用95%乙醇攪拌均勻，過濾，反復洗滌至濾出液近無色，60℃減壓干燥，得化合物3(176 g，含量＞98%，收率77.24%)。
2.1.2 合成路線2
取鳶尾黃素500 g，加NaOH 100 g，混勻，加95%乙醇1500 mL于10 L圓底燒瓶中，于水浴中加熱沸騰5 min，再加1000 mL硫酸二乙酯，反應30 min，取出，立即用鹽酸調pH至2～5，加水攪拌放冷。過濾，得淡黃色粉末，用95%乙醇攪拌均勻，過濾，反復洗滌至濾出液近無色，60℃減壓干燥，得化合物2(455 g，含量＞98%，收率76.69%)。取化合物2 200 g，加800 mL濃硫酸，攪拌溶解，反應2 h，傾入8 L NaCl飽和溶液中，邊加邊攪拌，析出沉淀，放置過夜，過濾，沉淀用水煮沸溶解，趁熱過濾，放置，析晶，過濾，重結晶一次，過濾，60℃減壓干燥，得化合物3(230 g，含量＞98%，收率89.39%)。
2.2 鳶尾黃素及其衍生物溶解度考察
按照中國藥典2015版一部凡例21的溶解度實驗方法進行了溶解度對比試驗：稱取3個化合物和鳶尾黃素適量，研成細粉，置于(25℃±2℃)一定量的溶劑中，每隔5 min強力振搖30 s；
觀察30 min內的溶解情況，并根據藥典對各種溶解性能的定義進行判斷。
2.3 化合物抗病毒實驗
2.3.1 組織半數感染量TCID50效價測定
將收集的含病毒的培養液做連續10倍稀釋，共14個濃度，分別加入培養有HeLa單層細胞的96孔板中，每濃度做3復孔。37℃、5%CO2培養3 d，觀察細胞病變情況，記錄結果，并采用Reed-Muench公式計算TCID50。
2.3.2 藥物的細胞毒性實驗
用RPMI-1640將各化合物配制為10.00 mg/mL，溶解后過濾除菌。同法將鳶尾黃素及利巴韋林注射液配制為10.00 mg/mL，過濾除菌后備用。將配制好的各化合物、鳶尾黃素和利巴韋林注射液做連續對倍稀釋，共7個濃度(10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31和0.16 mg/mL)，然后分別加入培養的HeLa細胞中，各濃度做3復孔，37℃、5%CO2培養3 d，觀察細胞病變情況，記錄結果，實驗重復3次。
2.3.3 受試藥物配制
根據受試藥物細胞毒性實驗結果，將各化合物的實驗起始濃度設定為4.00 mg/mL，然后再用RPMI-1640做連續對倍稀釋，共7個濃度(4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.13和0.06 mg/mL)，將配制好的藥液經過濾除菌后備用。根據藥物細胞毒性實驗結果和便于比較，將鳶尾黃素及利巴韋林注射液的實驗起始濃度也設定為4.00 mg/mL，然后再用RPMI-1640做連續對倍稀釋，共7個濃度(4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.13和0.06 mg/mL)，將配制好的藥液經過濾除菌后備用。
2.3.4 體外抗病毒實驗
待HeLa細胞在96孔板中培養生長成片，加入100×TCID50各病毒液0.1 mL，37℃、5% CO2吸附2 h，吸出未吸附病毒。分別加入稀釋好的各化合物、鳶尾黃素和利巴韋林注射液各濃度藥液，每個濃度做3復孔。37℃、5%CO2繼續培養，同時設立病毒對照組和細胞對照組，觀察細胞病變情況，記錄結果，實驗重復3次。
3.1 化合物的結構鑒定
鳶尾黃素 淺黃色針晶(EtOH)；
mp.214～216℃;UVλmaxnm:266;IR(KBr)νmax3410,1160,1520,1480,1250,1050 cm-1;ESI-MS:m/z299.05 [M-H]-1;1H NMR(DMSO,400 MHz)δ:13.09(1H,s,5-OH),10.77(1H,s,7-OH),9.58(1H,s,4"-OH),8.34(1H,s,H-2),7.37(2H,d,J=8.5Hz,H-2′,H-6′),6.82(2H,d,J=8.5Hz,H-3′,H-5′),6.44(1H,s,H-8),3.74(3H,s,6-OCH3);上述理化性質和光譜數據與文獻[2]報道一致，確定此商品為鳶尾黃素。
化合物1 淡黃色針晶(H2O)，HCl-Mg反應陰性；
AlCl3顯色呈淡黃色；
mp.166～168℃;UVλmaxnm:264;IR(KBr)νmax3465,1654,1652,1575,1494,1465,1278,1165,1070 cm-1;ESI-MS:m/z379.04 [M-Na]-1;1H NMR(DMSO,400 MHz)δ：12.84(1H,s,5-OH),7.88(1H,s,H-2),7.74(1H,d,J=2.0Hz,H-6′),7.25(1H,dd,J=2.0,8.5Hz,H-2′),6.94(1H,d,J=8.5Hz,H-3′),6.21(1H,s,H-8),3.70(3H,s,6-OCH3);上述理化性質和光譜數據與文獻[15]報道一致，確定此化合物為鳶尾黃素-5"-磺酸鈉。
化合物2 淡黃色結晶性粉末(EtOH)，HCl-Mg反應陰性；
AlCl3顯色呈淡黃色；
mp.163℃～166℃;UVλmaxnm:268;IR(KBr)νmax3465,1654,1608,1577,1490,1465,1290,1180,1074 cm-1;ESI-MS:m/z357.20 [M+H]+;1H NMR(DMSO,400 MHz)δ:12.80(1H,s,5-OH),7.86(1H,s,H-2),7.43(2H,d,J=8.5Hz,H-2′,H-6′),6.95(2H,d,J=8.5Hz,H-3′,H-5′),6.43(1H,s,H-8),4.15(2H,q,4′-OCH2-),4.06(2H,q,7-OCH2-),3.90(3H,s,6-OCH3),1.51(3H,t,4′-CH3),1.43(3H,t,7-CH3);上述理化性質和光譜數據與文獻[16]報道一致，確定此化合物為4",7-二乙基鳶尾黃素。
化合物3 淡黃色針晶(H2O)，HCl-Mg反應陰性；
AlCl3顯色呈淡黃色；
mp.166～168℃;UVλmaxnm:264;IR(KBr)νmax3475,1658,1602,1579,1498,1467,1265,1174,1052 cm-1;ESI-MS:m/z481.1 [M+Na]+;1H NMR(DMSO,400 MHz)δ：12.82(1H，s，5-OH),7.83(1H，s，H-2),7.74(1H,d,J=2.0Hz,H-6′),7.25(1H,dd,J=2.0,8.5 Hz,H-2′),6.95(1H,d,J=8.5Hz,H-3′),6.17(1H,s,H-8),4.08(2H,q,4′-OCH2-),3.72(2H,q,7-OCH2-),3.57(3H,s,6-OCH3),1.31(3H,t,4′-CH3),1.14(3H,t,7-CH3);13C-NMR(DMSO,100 MHz)δ:180.7(C-4),154.5(C-7),154.2(C-4′),153.4(C-2),152.7(C-9),152.4(C-5),133.5(C-2′),132.1(C-6),130.4(C-5′),125.6(C-1′),123.4(C-3),120.5(C-6′),115.3(C-3′),106.3(C-10),90.9(C-8),64.8(7-OCH2-),64.3(4′-OCH2-),60.7(6-OCH3),14.8(7-CH3),14.6(4′-CH3),確定此化合物為4",7-二乙基鳶尾黃素-5"-磺酸鈉。
3.2 溶解度試驗結果
按2.2項下規定，進行溶解度試驗，結果見表1。
表1 溶解度試驗結果Tab.1 Solubility test results
結果顯示，相比鳶尾黃素，化合物1和化合物3在甲醇中的溶解度均有所增加；
化合物2在氯仿中溶解度顯著提高，達到易溶；
化合物1和化合物3在水中溶解度大幅提高，達到溶解，有利于提高化合物在體內吸收和生物利用度。
3.3 TCID50效價結果
HeLa細胞感染病毒后，細胞出現腫漲變圓、脫落，細胞間隙變大，部分細胞貼壁能力下降并脫落、破碎。根據細胞病變效應結果，計算組織半數感染量(TCID50)，結果見表2。
表2 各病毒對HeLa細胞的TCID50(n=3)Tab.2 TCID50 of virus on HeLa cells(n=3)
3.4 藥物的細胞毒性實驗結果
將不同濃度的藥物分別加入培養的HeLa細胞后，有藥物組細胞形態發生改變，出現細胞破碎、脫落，細胞內遮光性顆粒多，細胞稀疏，表示該藥物組均出現細胞毒性。根據病變效應結果，采用MTT法在570 nm波長下測定A值，根據A值計算細胞存活率和病變率，運用SPSS 19.0 Probit回歸分析法計算得出各化合物、鳶尾黃素和利巴韋林注射液對HeLa細胞的半數毒性濃度(TC50)，結果見表3。
表3 藥物對HeLa細胞的TC50(n=3,±s)Tab.3 TC50 of drugs on HeLa cells(n=3,±s)
表3 藥物對HeLa細胞的TC50(n=3,±s)Tab.3 TC50 of drugs on HeLa cells(n=3,±s)
藥物TC50(mg/mL)化合物1 4.939±0.632化合物2 4.835±0.556化合物3 5.512±0.508利巴韋林9.743±0.645鳶尾黃素4.186±0.352
結果表明，化合物1、2、3對HeLa細胞毒性作用與利巴韋林比較無顯著性差異(P＞0.05)，與射干苷元比較無顯著性差異(P＞0.05)，TC50結果也顯示化合物1、2、3細胞毒性弱于射干苷元，證實其具有更小的細胞毒性，較高的濃度也不會出現細胞病變。
3.5 體外抗病毒實驗結果
在感染100 TCID50各病毒情況下，各藥物組和病毒對照組均出現了細胞形態改變、融合、壞死、脫落等，但是各藥物組細胞病變程度均低于病毒對照組，隨著各藥物組濃度的增加，對病毒抑制率增加，細胞病變率降低，細胞對照組無細胞病變。根據細胞病變效應結果，采用MTT法在570 nm波長下測定A值，根據A值計算細胞存活率和病變率，運用SPSS 19.0 Probit回歸分析法計算各化合物、鳶尾黃素和利巴韋林注射液的半數抑制濃度(IC50)和抗病毒指數(TI=TC50/IC50)，結果見表4。
表4 化合物對病毒的IC50和TI(n=3,±s)Tab.4 IC50 and TI of compounds to virus(n=3,±s)
表4 化合物對病毒的IC50和TI(n=3,±s)Tab.4 IC50 and TI of compounds to virus(n=3,±s)
與利巴韋林組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；
與鳶尾黃素組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
藥物病毒IC50(mg/mL)TI化合物1 H3N20.167±0.034*△△29.57 ADV30.787±0.065**△6.28 RSV0.174±0.025*△△28.39 CVB30.637±0.041*△△7.75化合物2 H3N20.648±0.036△7.46 ADV30.744±0.052*△6.50 RSV0.719±0.043*△6.72 CVB30.153±0.014**△△31.60化合物3 H3N20.155±0.032*△△35.56 ADV30.682±0.029*△△8.08 RSV0.161±0.011**△△34.24 CVB30.605±0.038*△△9.11利巴韋林H3N20.614±0.04015.87 ADV30.319±0.02230.54 RSV0.357±0.03627.29 CVB30.336±0.03929.00鳶尾黃素H3N20.923±0.0474.54 ADV30.894±0.0424.68 RSV0.875±0.0384.78 CVB30.969±0.0434.32
結果表明，各化合物組在不同劑量時對H3N2、ADV3、RSV、CVB3病毒均有不同程度的抑制作用，和鳶尾黃素比較差異有顯著性或十分顯著的統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，IC50遠小于同等劑量的鳶尾黃素組，說明較小藥物濃度就能更好地抑制病毒，證實了結構改造的可行性和必要性。
化合物1對RSV病毒有明顯的抑制作用，與利巴韋林比較有十分顯著性的統計學意義(P＜0.05)，抗RSV病毒指數略強于利巴韋林；
對H3N2病毒有明顯的抑制作用，與利巴韋林比較有顯著性的統計學意義(P＜0.05)，抗H3N2病毒指數強于利巴韋林；
化合物2對CVB3有明顯的抑制作用，與利巴韋林比較有十分顯著性的統計學意義(P＜0.01)，抗CVB3病毒指數略強于利巴韋林；
化合物3對RSV病毒有明顯的抑制作用，與利巴韋林比較有十分顯著性的統計學意義(P＜0.01)，抗RSV病毒指數略強于利巴韋林；
對H3N2病毒有明顯的抑制作用，與利巴韋林比較有十分顯著性的統計學意義(P＜0.05)，抗H3N2病毒指數(35.56)遠強于利巴韋林(15.87)，證明其具有很高的安全性和有效性。
結構改造是現代藥學重要組成部分，從中藥或天然植物來源的化合物，由于療效不理想、有毒副作用或水溶性差等問題，很少直接應用于臨床，需要對某些官能團進行結構修飾、改造，以達到改變療效、降低毒副作用及增加生物利用度的目的。鳶尾黃素由于近似平面結構，脂溶性、水溶性均較差，影響其生物活性，可以通過結構改造來達到增效的目的。袁崇均[17]通過對鳶尾黃素開環形成查爾酮衍生物，證實其對HCT116、MCF-7、A549、SGC7901和SK-ov-3細胞株顯示出較強的抗腫瘤活性；
通過對鳶尾黃素脫甲基形成為6-OH染料木素，證實其對H2O2誘導PC12細胞損傷有顯著的保護作用[18]；
陳帥通過鳶尾黃素8位活潑H形成Mannich堿，證實其對H22肝癌荷瘤小鼠有很強的抗腫瘤作用[19]；
郭常亮提供一種梭菌AUH-JLC39及其在鳶尾黃素轉化中的應用，解決了二氫鳶尾黃素的微生物生物合成問題及其資源匱乏問題[20-21]。
在藥物研發中，抗病毒藥物的研究起步較晚，臨床上能有效地治療病毒性疾病的藥物十分有限，主要是因為抗病毒藥物在發揮藥效殺死體內病毒的同時，會損傷自身細胞，往往具有較高的毒副作用，其臨床應用多具有一定限制。利巴韋林具有廣譜的抗病毒作用[10-14]，廣泛用于治療病毒感染，但臨床研究表明，長期服用利巴韋林會使白細胞水平降低，產生骨髓抑制等不良反應[22]。因此從天然植物中尋找抗病毒藥物，篩選高效低毒的抗病毒藥物是當今抗病毒研究熱點之一。
TI通常稱為治療指數(therapeutic index)，表示藥物的安全性結果，用在抗病毒方面稱為抗病毒指數，由藥物的半數毒性濃度(TC50)/半數抑制濃度(IC50)得到，通常半數毒性濃度越大，半數抑制濃度越小，藥物就越安全有效。H3N2流感是一種由甲型H3N2流感病毒引起的呼吸系統疾病，可以通過呼吸道傳播，患者多表現出普通流行性感冒的癥狀，目前對甲流病毒尚缺乏特效藥物，常洋通過研究證實牛黃清感膠囊對甲型H3N2流感病毒具有顯著抑制作用，TI為27[10]；
李爽等[23]證實空心蓮子草有效部位提取物對流感病毒有明顯抗病毒生物合成作用，其TI為2.43。本研究所合成的化合物3，TC50與利巴韋林相當(P＞0.05)，對H3N2病毒的IC50為0.155±0.032 mg/mL，TI為35.56，具有廣譜高效、安全低毒的抗病毒活性，具有較高的開發利用價值，下一步將研究化合物3構效關系，尋找其抗H3N2病毒的靶點，從分子機制方向探討其抗病毒原理。
致謝：NMR光譜、MS由四川大學分析測試中心完成，部分活性試驗由四川大學華西醫學中心完成。
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