趙 湘 馮 潔 王瀟瀟 葛化冰
牙周炎是由牙菌斑微生物引發的、發生在牙周支持組織(牙齦、牙槽骨、牙周膜、牙骨質等)的慢性、感染性疾病，可導致軟組織炎癥、牙槽骨丟失[1,2]。牙周感染不僅影響口腔健康，還與多種疾病相關，如心腦血管疾病、中風、新生兒早產和低體重等[3]，對患者的生存質量亦會產生負面影響。牙周炎的診斷目前主要依靠影像學技術和牙周檢查指數包括牙周探診深度、臨床附著喪失等，具有一定的滯后性[4]，且不適用于大規模的臨床篩查。齦溝液來源于齦溝或者牙周袋，能密切反映牙周組織狀態的改變，是評估牙周健康或疾病的重要量化指標，但是成年人每天齦溝液的分泌量有限，僅0.5～2.4ml，且在收集的過程中，易受唾液、細菌菌斑等的污染，單個位點采集的齦溝液所包含的信息量有限，不能有效反映全口腔的牙周狀況[5]。唾液含有免疫球蛋白、酶、大量電解質及黏蛋白等成分，能有效反映口腔衛生或疾病狀況，臨床快速篩查具有高靈敏度和高效益的特點[6]。牙菌斑生物膜并不是細菌的簡單堆積，而是多種微生物組成的生物群落，多種細菌通過相互交錯的信號傳導通路協調作用，具有高度的結構性[7]。有研究[8]表明，牙周病患者的菌斑中存在大量的致病微生物。由于牙周病病因不明確，牙周檢查依賴于檢查者的診斷經驗，主觀性較強，結合個人病史、影像學檢查，往往錯過疾病的早期診斷，遺漏潛在病灶。因此，尋找有效、客觀且能反映疾病進展的相關指標至關重要。本研究通過檢測并比較不同嚴重程度的牙周炎患者唾液生物標志物以及菌斑生物膜致病菌水平，探究牙周炎患者不同疾病嚴重程度與生物標志物水平間的關系。
1.1 一般資料 選擇2018 年6 月-2021 年3 月首都醫科大學附屬北京口腔醫院收治的牙周炎患者126 例作為研究對象，納入標準：①年齡＞60歲；
②符合《牙周病診療指南》[9]制定的牙周炎診斷標準；
③口內6 個區段至少有一個區段功能牙≥2 顆；
④1 年內未進行牙周治療。排除標準：①既往有糖尿病、自身免疫性疾病、全身性疾病、代謝性骨疾病史；
②合并胃癌、食管癌及其他惡性腫瘤、急慢性感染疾病；
③近3 個月內曾服用抗生素/ 非甾體類藥物；
④患有胃靜脈曲張、門靜脈高壓性胃病；
⑤臨床資料不全。研究組患者平均年齡(67.54±4.16)歲，男性69 例，女性57 例。同期于體檢中心進行口腔檢查，符合《牙周病診療指南》 中牙齦健康者126 例健康者作為對照組，對照組平均年齡(67.83±4.57)歲，男性65 例，女性61 例，研究組患者和對照組患者的年齡、性別均無顯著差異。本研究已經本院醫學倫理委員會審查通過。
1.2 研究方法
1.2.1 口腔檢查 每位研究者均選取6 顆指數牙，即代表性牙位16、11、26、36、31、46，若有缺失則以該牙相鄰的牙位代替。每顆牙檢查6 個位點：近頰、正中頰、遠頰、近舌、正中舌、遠舌。采用Hufriedy 刻度探針，測定并記錄所有研究對象的附著喪失(attachment loss，AL)、探診深度(probing depth，PD)、探診出血(Rleeding on probing，ROP)。研究組患者進行口腔影像學檢查，聯合口腔檢查判別疾病的嚴重程度。牙周病的嚴重程度分級，輕度：AL＜3mm，PD≤4mm，影像學檢查結果顯示牙槽骨吸收＜根長的1/ 3；
中、重度牙周病：AL≥3mm，PD＞4mm，影像學檢查結果顯示牙槽骨吸收≥根長的1/ 3。研究組患者根據牙周病嚴重程度分為兩個亞組，即輕度組和中重度組。
1.2.2 唾液收集及相關指標的檢測 禁食禁水1 個小時以上，采用無菌容器收集每個研究對象的唾液(2～5ml)，離心(4℃，8000rpm，5min)后收集上清液，-80℃保存備用。
(1)牙周組織炎癥標記物的檢測采用酶聯免疫吸附(ELISA)檢測唾液中白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子-α(Yumor necrosis factor-α，YNF-α)水平。
(2)牙周組織破壞標記物的檢測 采用酶聯免疫吸附(ELISA)檢測唾液中基質金屬蛋白酶-8(matrix metalloproteinases-8，MMP-8)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)水平。
1.2.3 菌斑生物膜中定殖細菌的檢測 采用無菌齦下刮治器從研究對象牙齒(所有指數牙)的近中頰面處收集齦下菌斑，置于無菌且含有500μL PRS的EP 管中，離心(4℃，13000rpm，5min)，-80℃保存用于DNA 的提取。采用探針法實時熒光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechain reaction，RY-qPCR)檢測牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)、福賽坦氏菌(Yannerrellaforsythia,Y.forsythia)和齒垢密螺旋體(Yreponemadenticola,Y.denticola)水平。引物序列見表1。
表1 RY-qPCR的引物序列
1.3 統計學處理 采用統計學軟件SPSS 22.0進行統計學分析，計數資料采用率(n,%)表示，組間差異采用卡方檢驗；
符合標準正態分布的計量資料采用()表示，多組組間差異采用方差分析，若P＜0.05，每兩組組間差異采用SNK 檢驗；
不符合標準正態分布的計量資料，采用四分位數表示，組間差異采用秩和檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。
2.1 牙周健康指標的比較 研究組患者的PD值、AL 值以及ROP 陽性率均顯著高于對照組，且在研究組中，中重度患者的指標水平較輕度組均有顯著提高，見表2。
表2 牙周健康指標的比較
2.2 唾液生物標志物水平的比較 研究組患者較對照組IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平均顯著提高，差異具有統計學意義；
研究組中，中重度組患者的唾液IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9水平顯著高于輕度組患者，差異具有統計學意義，見表3。
表3 唾液生物標志物水平的比較
2.3 菌斑生物膜中三種細菌菌量值比較 研究組患者檢測的3 種細菌菌量顯著高于對照組，且研究組中中重度牙周病患者，菌斑生物膜檢測的細菌量顯著高于輕度組患者，差異具有統計學意義，見表4。
表4 菌斑生物膜中三種細菌菌量值比較
2.4 牙周基礎治療后唾液生物標志物水平的比較 經牙周基礎治療后，研究組IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平均顯著降低，但是較對照組水平依舊較高，差異具有統計學意義，見表5。
表5 牙周基礎治療后唾液生物標志物水平的比較
牙周病是導致成人失牙的首要原因，采取有效的治療措施對于患者牙齒的留存、使用周期至關重要。目前，臨床針對牙周病的檢測，主要集中于齦溝液生物標志物的檢測，臨床應用尚存在一定的局限性。在本研究中，收集所有研究對象的唾液作為樣本，具有非侵入性、客觀、便攜、易操作的優點[10]，測定了牙周組織炎癥標記物IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 以及YNF-α，還測定了牙周組織破壞標記物MMP-8、MMP-9。本研究同時檢測了齦下菌斑中的微生物牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)、福賽坦氏菌(Yannerrellaforsythia,Y.forsythia)和齒垢密螺旋體(Yreponemadenticola,Y.denticola)，即“紅色復合體(red complex)”，紅色復合體是世界牙周病研討會公認的牙周病主要的致病菌群[11]。
本研究結果表明，牙周炎患者唾液IL-1β、IL-8 水平均顯著提高。唾液中含有多種蛋白質，在維持口腔穩定的過程中發揮重要作用。當口腔穩態被打破，宿主在免疫應答的過程中產生了大量的細胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ等。在牙周組織炎癥反應開始期間，細胞因子從上皮細胞、巨噬細胞以及結締組織成纖維細胞和中釋放出來[12]。本研究中，中重度牙周炎患者唾液IL-1β、IL-8 水平較輕度牙周炎患者水平升高，其水平與疾病嚴重程度有關。有研究[13]表明，IL-1β 與牙周炎癥參數間存在關聯，不僅能反映疾病的嚴重程度，還能評估患者的治療效果。
隨著牙周炎的進展，牙周組織被破壞，相關的酶如基質金屬蛋白酶(MMPs)等被釋放到唾液中。有研究[14]表明，隨著牙周病變程度的加深，齦溝液中的MMP-8 水平逐漸增加。當牙周炎癥開始時，細胞因子釋放，MMPs 等相關的酶釋放，導致結締組織膠原蛋白的降解。當結締組織炎癥、降解之后，進一步向齦溝液、牙周袋轉移，隨后釋放到唾液中。有研究[15]表明，MMP-8、MMP-9 在診斷牙周炎時具有很高的診斷價值。本研究中，輕度牙周炎患者的MMP-8、MMP-9 水平較中重度患者低，可反應疾病的嚴重程度。
本研究中，評估了所有研究對象齦下菌斑中的致病微生物，結果表明，牙周炎患者菌斑中致病微生物水平顯著提高。有研究[16]表明，牙周病患者的臨床表現與炎癥水平、菌斑生物膜均有關聯，牙周基礎治療后，齦下菌斑中的紅色復合體顯著降低。牙周致病菌并不是單獨存在，而是在齦下菌斑內共聚，以復合體的形式被發現，協同致病[17]。此外，本研究發現，經牙周基礎治療后，患者唾液中的IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平較治療前有所降低，但是較健康對照組仍顯著升高，推測可能與參與疾病本身有關。本研究中發現，中重度牙周炎患者齦下致病菌數量較輕度患者顯著升高，提示致病微生物濃度與疾病嚴重程度相關。
綜上所述，牙周病患者唾液炎癥因子標志物及牙周組織破壞標志物水平均顯著提高，且與疾病嚴重程度間存在關聯；
牙周病患者齦下菌斑中致病菌水平顯著提高，且與疾病嚴重程度相關。本研究為橫斷面研究，納入的樣本量較小，旨在探究牙周疾病及疾病嚴重程度患者，唾液生物標志物及菌斑致病菌水平間的差異，為進一步臨床研究提供科學依據。