魯有望，董榮靜，石 年，陳用軍
（1.湖北理工學院醫學院，湖北 黃石 435001；
2.鄂東醫療集團黃石市中心醫院/湖北理工學院附屬醫院皮膚科，湖北 黃石 435000）
銀屑病（俗稱牛皮癬）是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，以鱗屑性紅斑伴瘙癢為主要特征。銀屑病是一種多基因、遺傳、免疫、環境等因素共同介導的免疫炎癥性皮膚病，目前被認為是一種多系統代謝性疾病，常合并高血壓、2型糖尿病、冠心病等。銀屑病的全球平均發病率約為2%～4%，成人銀屑病的發病率在中國臺灣省約為30.3/10萬人年，意大利約為321.0 / 10萬人年，東亞約為0.14%，大洋洲約為1.99%，近年來銀屑病的發病率呈上升趨勢［1］。目前國際指南推薦的治療方法主要包括局部治療、光療、常規全身治療、免疫抑制劑和生物療法等［2］。由于傳統藥物系統療法副作用明顯，而生物制劑費用高昂，長期用藥會導致患者依從性變差且經濟負擔過重［3，4］。因此，使用具有較好臨床療效的中藥復方制劑作為治療銀屑病的替代或補充藥物成為可能［5］。
目前已知可用于治療銀屑病的中藥材有數百種，已批準用于臨床的處方藥（消銀顆粒、克銀丸、消銀丸）及中藥湯劑（涼血消斑湯、清熱涼血方、四物湯）聯合其他西藥施治對尋常型銀屑病具有顯著療效［6～8］。根據中醫理論，銀屑病也稱“白疙”或“松皮癬”，主要分為“血熱證、血瘀證、血燥證、血毒證、血虛證”，是中醫中藥辨證論治的基本證型［9］。但是，中藥的具體治療機理和具體藥效靶點等仍不清楚。目前，基于網絡藥理學可更進一步明確中藥中的核心成分及可能的作用靶點，使開發療效佳且靶點明確的中藥活性成分成為可能。
消銀顆粒由地黃、牡丹皮、赤芍、當歸、苦參、金銀花、玄參、牛蒡子、蟬蛻、白鮮皮、大青葉、紅花、防風等13味藥材制成，具有清熱涼血、養血潤燥、祛風止癢等功能，用于血熱風燥型和血虛風燥型白疵［10］。但是，對消銀顆粒治療銀屑病的有效成分與治療機制尚缺乏研究。因此，本研究通過網絡藥理學結合生物信息學技術，構建“成分—靶點—通路—疾病”多維網絡，探索消銀顆粒治療銀屑病的潛在分子機制，為中藥復方的臨床應用，以及銀屑病相關疾病的基礎與臨床研究提供一定的理論依據。
1.1 消銀顆?；钚猿煞趾Y選及作用靶點的獲取 通過中藥系統藥理學分析平臺（Traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）［11］，數據庫檢索消銀顆粒的13種成分：地黃、牡丹皮、赤芍、當歸、苦參、金銀花、玄參、牛蒡子、蟬蛻、白鮮皮、大青葉、紅花、防風包含的活性成分。其中，對于成分的篩選條件設置為：生物利用度（Bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（Drug-like properties，DL）≥ 0.18，再利用UniProt數據庫（http：//tcmspw.com/index.php）校正靶點蛋白為規范的基因名稱，刪除無靶點成分，整理得消銀顆粒的有效成分及對應靶點數據信息。
1.2 消銀顆?；钚猿煞帧悬c網絡的構建 通過藥物靶標數據庫（Therapeutic target database TTD）、Drugbank、Disgenet、Genecards數據庫獲取銀屑病相關的治療靶點，并取交集。
1.3 銀屑病差異基因表達分析 從基因表達（Gene expression omnibus，GEO）數據庫中下載銀屑病皮損及皮損旁組織轉錄組數據集（GSE13355），采用limma包比較銀屑病皮損與正常組皮膚的基因表達水平差異性（銀屑病組比正常組）。兩組按照adj.P.Value＜ 0.05 & log FC ＞ 1篩選。
1.4 消銀顆粒治療銀屑病的關鍵靶點基因GO功能與KEGG通路富集分析 成分靶點與疾病靶點進行映射，以獲得中藥復方治療銀屑病的潛在靶點。為說明中藥復方治療銀屑病的潛在靶點在基因功能和信號通路中的作用，本項目使用R軟件Cluster Profiler包進行基于基因本體（Gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的富集分析，尋找差異表達基因集合內大量基因共同的功能及相關通路。通過基因的富集分析預測中藥復方治療銀屑病的可能分子機制。
1.5 PPI 蛋白互作網絡的構建 為了更好地分析靶點蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein interaction，PPI），借助STRING Version 11.0數據庫（https：//string-db.org/）構建潛在靶點的PPI網絡，限定物種為人（Homo sapiens），去除孤立靶點。再將PPI網絡圖導入Cytoscape3.6.1軟件進行拓撲屬性分析，分析網絡圖中的關鍵節點及度值，得到核心靶點。
1.6 消銀顆粒核心成分與關鍵靶基因的分子對接驗證 采用Autodock Vina軟件（0.8）對核心靶點中度值最大靶點蛋白與中藥復方中的關鍵成分進行分子對接分析。通過PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取中藥小分子配體的三維結構。從RCSB PDB結構數據庫（www.rcsb.org/）中獲得靶點蛋白的三維結構，用Pymol軟件去除受體蛋白中的溶劑。應用Autodock Vina軟件在Windows環境下批量對接，得到結合能，用Discovery Studio 2016軟件對對接結果進行可視化分析。首先，從PDB得到關鍵靶點的蛋白結構，包括FOS（2wt7）、IL-1B（5r87）、MMP-9（6esm）及CCL-2（1dom）的3D結構，并去除其原本所帶有的小分子及水分子，通過PyMol完成蛋白質加氫。從TCMSP數據庫中得到了聯系緊密的活性成分結構，并且同樣使用autoDock對小分子進行電荷平衡、可旋轉的鍵檢查。之后，通過選擇蛋白質的盒子范圍，計算合適的位點。
2.1 消銀顆粒主要活性成分 消銀顆粒主要活性成分有198種，這里僅列舉排名前20的活性成分（見表2-1），主要包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素等。
表2-1 消銀顆粒主要活性成分表
續表2-1
2.2 消銀顆?；钚猿煞帧悬c對應關系 在TCMSP數據庫查詢消銀顆?；钚猿煞謱悬c。消銀顆粒中篩選出198種活性成分，在刪除重復后，此198種活性成分對應靶點蛋白共254個。采用軟件Cytoscape 3.6.1分析活性成分-靶點的對應關系（見圖2-1）。
圖2-1 消銀顆?；钚猿煞?靶點圖（紅色代表消銀顆粒的13種成分，綠色代表198種活性成分，紫色代表活性成分對應的254個靶點蛋白）
2.3 銀屑病皮損與正常皮膚差異基因表達
2.3.1 銀屑病差異表達基因篩選 我們在GEO數據庫篩選銀屑病相關數據集，比較數據集GSE13355銀屑皮損和正常組皮膚表達譜差異，采用limma包分析正常組和銀屑病組差異基因。取adj.P.Value＜ 0.05 & log FC ＞ 1作為篩選標準。得到差異表達基因635個，其中上調基因487個，下調基因148個（見圖2-2）。2.3.2 消銀顆粒治療銀屑病的關鍵靶點篩選 我們通過TTD、Drugbank、Disgenet、Genecards數據庫獲取銀屑病相關的治療靶點共4408個（見圖2-3A）。進一步將獲取到的銀屑病差異表達基因與銀屑病相關治療靶點基因，消銀顆粒靶點基因取交集，共有24個基因交集，這些交集基因可能與消銀顆粒治療靶點相關（見圖2-3B）。
圖2-2 銀屑病差異基因火山圖
圖2-3 藥物靶點、銀屑病治療靶點、銀屑病差異基因交集
2.4 交集基因的 GO 功能與 KEGG通路富集分析 我們對24個交集基因進行信號通路富集分析，用條形圖來展示 GO 富集分析 BP 、CC 、MF目錄下排名前10富集結果?？梢钥吹脚琶?0的GO條目主要富集到趨化因子受體結合、細胞因子受體結合、對脂多糖和活性氧的反應等（圖2-4A）。KEGG富集分析表明，這些基因與IL-17信號通路、TNF-信號通路等相關，推測消銀顆粒主要核心成分槲皮素可能作用于IL-17信號通路、TNF-信號通路抑制IL-17和TNF-7分泌發揮抗炎作用，從而改善銀屑病癥狀。我們用氣泡圖來展示KEGG富集結果（見圖2-4B）。
圖2-4 A. GO富集條形圖（縱坐標表示Pathway條目，橫坐標表示p值）；
B. KEGG富集氣泡圖（縱坐標表示富集的KEGG Term，橫坐標p值）
2.5 消銀顆粒治療銀屑病的關鍵靶點蛋白相互調控網絡構建 我們得到了24個中藥復方治療銀屑病的潛在靶點基因。其中，靶點網絡中聯結度最高的蛋白為FOS（2wt7）、IL-1B（5r87）、MMP-9（6esm）及CCL-2（1dom）。（見圖2-5）。
圖2-5 中藥復方治療銀屑病潛在靶點PPI網絡（顏色深淺代表關聯程度）
2.6 消銀顆粒核心成分槲皮素作用于FOS、IL-1B、MMP-9及CCL-2蛋白的分子對接驗證結果 我們針對FOS、IL-1B、MMP-9及CCL-2蛋白及其配體槲皮素進行分子對接。然后，使用Genetic算法得到計算的結果，最后利用PyMol軟件進行可視化以及美化（見圖2-6）。
圖2-6 消銀顆粒核心成分槲皮素作用于FOS、IL-1B、MMP-9及CCL-2蛋白的分子對接驗證
消銀顆粒成分復雜，主要具有清熱涼血、養血、祛風止癢、潤燥等功能，臨床上廣泛應用于治療輕-中度銀屑病，聯合其他制劑治療重度銀屑病亦有顯著療效。研究發現消銀顆粒聯合阿維A膠囊可有效改善中-重度銀屑病患者的臨床癥狀，并抑制機體炎性因子水平（IL-17、IL-22、TNF-α、VEGF等），降低復發率等作用［6，12，13］。消銀顆粒聯合卡泊三醇軟膏對改善銀屑病患者鱗屑、瘙癢癥狀更顯著［14］。但是，目前消銀顆粒具體活性成分以及確切治療靶點尚不清楚。
我們通過TCMSP數據庫篩選出中藥復方消銀顆粒的活性成分，并通過TCMSP和UniProt數據庫篩選出活性成分的靶點。同時通過查找BATMANTCM、ETCM中草藥有效成分可能靶向的基因靶標。通過TTD、Drugbank、Disgenet、Genecards數據庫獲取銀屑病相關的治療靶點。比較正常皮膚和銀屑病患者皮損組織表達譜得到差異表達基因。然后篩選疾病靶點、差異基因求交集找到關鍵靶點，并對關鍵靶點進行功能富集分析。對關鍵靶點構建PPI網絡互作，PPI蛋白互作分析表明FOS、IL-1B、MMP-9及CCL-2處于蛋白互作的中心，與其他蛋白具有更多的聯系。最后使用AUTODOCK進行分子對接。結果表明，FOS、IL-1B、MMP-9及CCL-2與槲皮素具有較高的結合親和力。
我們進一步對銀屑病差異表達基因、消銀顆粒關鍵靶點基因及銀屑病治療靶點基因三者取交集，共有24個基因存在交集，這些基因主要富集在經典IL-17信號通路和TNF-α信號通路上，推測消銀顆粒的核心成分可能主要作用于此通路上。銀屑病組織病理學的典型特征即表皮或真皮內大量炎細胞浸潤（淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞），角質形成細胞過度增生，表皮角化過度、角化不全和棘層增厚等。銀屑病發病或病情惡化時，活化的樹突狀細胞產生TNF-α和IL-23等炎癥介質。TNF-α是一種促炎癥細胞因子，可通過多種不同的途徑增強炎癥反應。TNF-α由多種細胞類型產生，包括巨噬細胞、淋巴細胞、角質形成細胞和內皮細胞，并在幾種不同的細胞類型上發揮其活性。TNF-α還可進一步誘導其他炎性介質和粘附分子產生，所有這些均與銀屑病病理機制相關［15］。TNF-α不僅能調節樹突狀細胞的抗原遞呈功能，還能促進T淋巴細胞的浸潤，通過磷酸化NF-κB通路在銀屑病中起促進炎癥作用［16］。TNF-α還可調節IL-23/Th17軸在銀屑病中促進炎癥反應，阻斷TNF-α可減輕銀屑病的炎性反應，改善銀屑病皮損［20～21］。因此，TNF-α阻斷劑如依那西普，英夫利昔單抗，阿達木單抗等生物制劑的臨床成功并不令人驚訝。阻斷TNF-α信號通路的靶向生物制劑在銀屑病治療中具有顯著療效，但價格高昂仍然限制了其廣泛應用。消銀顆粒的活性成分槲皮素可能作用于TNF-α信號通路抑制炎性因子分泌而具有一定療效。
最近研究認為IL-23/IL-17軸可能是銀屑病發病機制的基礎。銀屑病患者中Th17細胞及IL-17水平顯著高于健康人群，由Th17細胞分泌的IL-23和IL-17在促進銀屑病炎癥反應中起重要作用。IL-17可誘導角質形成細胞增殖，引起銀屑病皮損炎癥和斑塊形成。IL-17、IL-22和TNF-α可以刺激角質形成細胞、黑素細胞、成纖維細胞以及DCs產生TNF-α、IL-1β和IL-6［17］。IL-17還可促進細胞間粘附分子1（ICAM-1）和趨化因子（CCL20、CXCL1、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL8等）分泌并可進一步招募DCs、記憶性T細胞和中性粒細胞到達損傷部位促進炎癥反應［18］。其中，CXCL1和CXCL8還可募集并增強皮膚中的中性粒細胞活性，故Th-17通路在銀屑病發病機制中是必不可少的。局部咪喹莫特可誘導小鼠銀屑病樣皮損，主要通過IL-23/Th-17軸介導［19］。使用抗IL-23抗體阻斷IL-23/IL-17軸可抑制銀屑病的病情進展［20］。IL-17信號通路和Th-17細胞通路功能失調促進了銀屑病的慢性炎癥，逆轉該通路是目前銀屑病臨床試驗的重點。目前針對阻斷IL-17的生物制劑如蘇金單抗、Ixekizumab和Brodalumab在臨床具有顯著療效。通過KEGG富集分析發現消銀顆粒主要活性成分可能針對IL-17信號通路具有抑制作用，從而協同治療銀屑病。
目前，生物制劑成本依舊是大多數患者考慮因素，長期規律使用較為困難。消銀顆粒中核心成分主要作用于IL-17信號通路和TNF-α信號通路上，從而發揮抗炎、減少炎性因子分泌等治療作用。其核心成分中的槲皮素及其作用配體或可成為新的成分制劑應用于銀屑病治療。槲皮素生物活性多樣，具有抗炎、抗菌、抗氧化、免疫調節等作用，是一種黃酮小分子化合物［21］。目前槲皮素在腫瘤、炎癥及動脈粥樣硬化中的作用相繼報道。研究發現，槲皮素可減輕喉炎小鼠局部組織炎癥，主要通過平衡Th-17 /Treg以及降低Th-17細胞分化［22］。槲皮素可抑制人乳腺癌細胞的增殖并誘導其凋亡［23］。研究還發現，槲皮素在結直腸癌中具有潛在化學預防作用［24］。槲皮素通過刺激人HaCaT角質形成細胞ROS依賴的p53蛋白泛素化而增強砷誘導的凋亡［25］。槲皮素還可通過NF-κB通路改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損炎癥反應［26］。
我們得到的前24個中藥復方治療銀屑病潛在靶點，分 別 是FOS、IL-1B、MMP-9、CCL-2、CCL-8、CXCL-10等，推測可能其是消銀顆粒核心成分在銀屑病中的主要治療靶點。研究發現IL-1B在銀屑病皮損和咪喹莫特誘導的小鼠皮損中顯著升高。此外，IL-1R信號通路與銀屑病的病情進展和治療反應相關，IL-1B-IL-1R信號通路可能通過直接調控真皮IL -17產生和刺激角質形成細胞放大炎癥級聯反應，參與皮膚炎癥和銀屑病的發?。?7］。研究發現，與健康皮膚相比，CCL2在銀屑病皮損中顯著增高，且CCL2介導的pDC招募到咪喹莫特誘導的炎癥皮損依賴于DC中的c-Jun［28］。在銀屑病患者中，角質形成細胞是單核細胞趨化蛋白1（MCP-1/CCL2）的主要來源，CCL2在銀屑病皮損的角質形成細胞中高表達，CCL2與主要在單核細胞表面表達的趨化因子受體CCR2結合后，單核細胞分化為巨噬細胞，并從血流中遷移到炎癥部位從而導致銀屑病的發生，因此推測CCL2可能是監測銀屑病進展的潛在生物標志物［29］。
基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）參與了細胞外基質組成的修飾，促進血管生成和白細胞滲入真皮。皮損中MMP-9表達與銀屑病疾病活動度相關［30］。此外，MMP-9與炎癥細胞的激活相關，其循環水平與銀屑病的嚴重程度相一致［31］。MMP-9的誘導可能是銀屑病發病的關鍵機制之一，在銀屑病患者血清中，MMP-9的含量升高［32］，且其分泌可能受TNF-α調控，在英夫利昔單抗單藥治療三周后，MMP-2、MMP-9、TNF-α和e -選擇素的水平降低，并伴隨臨床癥狀顯著改善，因此MMP-9水平與PASI之間具有顯著的相關性［31，33］。此外，中性粒細胞來源的MMP-9通過激活皮膚血管內皮細胞誘導血管舒張和增加通透性，從而促進銀屑病病變的發展［34］。消銀顆?？赡芡ㄟ^抑制MMP-9而改善銀屑病癥狀。
FOS樣抗原1（fra1）是一種原癌基因，它是轉錄因子激活蛋白1（AP-1）活性的負抑制物，具有轉化活性，在銀屑病皮損中，fra1蛋白表達量較高。fra1可通過抑制細胞周期，抑制細胞凋亡，從而促進HaCaT細胞體外生長，提示fra1可能在銀屑病中起重要作用［35］。AP-1（Jun/Fos）由Jun、Fos和活化轉錄因子蛋白家族組成的二聚體，是許多細胞功能的中央調節器。Fos和Jun蛋白在發育和調節細胞增殖、分化和細胞轉化的原型癌基因［36］。Jun蛋白控制細胞因子和趨化因子的表達，Jun蛋白可通過轉錄和轉錄后調控細胞因子的表達，如粒細胞集落刺激因子、IL-6和TNF-α，可能與炎癥性皮膚病（如銀屑病）相關。調節角質形成細胞中的Jun/AP-1活性可以觸發趨化因子/細胞因子的表達，導致中性粒細胞和巨噬細胞聚集到表皮，從而導致銀屑病皮損的病理改變。
我們進一步對核心成分靶點預測發現，FOS（2wt7）、IL-1B（5r87）、MMP-9（6esm）及CCL-2（1dom）在靶點網絡中聯結度最高，說明與藥物發揮作用最相關。我們針對FOS、IL1B、MMP9及CCL2蛋白及其配體槲皮素進行分子對接。期待合成與槲皮素相關靶點明確的藥物運用于銀屑病治療。
綜上所述，槲皮素可能作為一個潛在的藥物小分子，可能通過經典的IL-17信號通路及TNF-α信號通路并作用于FOS、IL-1B、MMP-9及CCL-2蛋白起抗炎、促進角質形成細胞凋亡、抑制炎性因子趨化等途徑，在銀屑病中起治療作用。本研究旨在闡明中藥復方對治療銀屑病的分子機制，并為開發療效佳且靶點明確的中藥活性成分提供理論依據。
猜你喜歡槲皮素銀屑病靶點維生素D受體或是糖尿病治療的新靶點中老年保健(2021年3期)2021-12-03腫瘤免疫治療發現新潛在靶點中國生殖健康(2020年7期)2020-12-10槲皮素改善大鼠銅綠假單胞菌肺感染中成藥(2017年9期)2017-12-19槲皮素誘導MCF-7細胞凋亡及其與Fas/FasL通路的相關性研究中國病理生理雜志(2015年8期)2015-12-21槲皮素通過抑制蛋白酶體活性減輕心肌細胞肥大中國病理生理雜志(2015年8期)2015-12-21心力衰竭的分子重構機制及其潛在的治療靶點醫學研究雜志(2015年7期)2015-06-22尋常型銀屑病合并手指Bowen病一例中國醫學科學院學報(2015年5期)2015-03-01中醫辨證論治聯合308nm準分子光治療尋常型銀屑病的效果觀察中國當代醫藥(2015年32期)2015-03-01鈣泊三醇倍他米松軟膏在銀屑病治療中的應用中華皮膚科雜志(2014年4期)2014-12-19妊娠與銀屑病中華皮膚科雜志(2014年3期)2014-12-19