孫靖輝，林 豪，王 闊，曾欽成，李 賀，王春梅，陳建光
(北華大學藥學院，吉林 吉林 132013)
代謝相關脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)作為一種與肥胖、高血脂及代謝綜合征密切相關的慢性疾病，已成為嚴重的全球性公共衛生問題[1].然而，目前尚無藥物被批準直接用于MAFLD的治療，臨床上主要是通過減少MAFLD相關的危險因素來達到治療目的.中藥治療MAFLD具有獨特的優勢，研究[2]表明，中醫藥能有效改善胰島素抵抗，降低肝臟脂質沉積和減輕肝臟炎癥.
五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，作為我國代表性補益類藥物已應用2000余年[3].五味子的有效活性成分包括木脂素、多糖和揮發油等，其中木脂素(Schisandrachinensislignans，SCL)是五味子主要的活性成分，有治療肝損傷、慢性咳嗽、平喘、鎮靜、抗衰老及神經保護等功效[4-6].然而，對于五味子治療MAFLD的具體成分尚不明確，其肝臟保護機制還有待進一步闡明.
如果運用傳統的研究手段篩選五味子治療MAFLD的有效成分，實驗樣本量巨大，研究周期較長，也很難在MAFLD復雜的發病機制中確定五味子的潛在作用靶點.根據SCL在大鼠體內的分布[7]顯示，在肝臟中檢測出12種SCL原型成分，如戈米辛J、五味子醇乙、五味子酚等.因此，本研究通過網絡藥理學篩選肝臟中12種SCL原型成分治療MAFLD的核心成分和關鍵靶點，再通過分子對接技術模擬核心成分和關鍵靶點的結合情況預測五味子治療MAFLD的作用靶點及機制.
1.1 網絡藥理學分析
1.1.1 成分靶點預測
表1 口服五味子總木脂素后在肝臟中檢測到的12種SCL
1.1.2 疾病靶點預測
1.1.3 治療MAFLD的作用靶點篩選及蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖的構建
1.1.4 成分-交集靶點網絡圖的構建及富集分析
1.2 分子對接驗證
2.1 網絡藥理學的靶點篩選和富集分析
通過TCMSP數據庫檢索，將得到的靶點進行合并，除去重復項，最終得到與12種SCL原型成分相關的1361個靶點.通過MAFLD的靶點篩查后，得到相關靶點627個，其中，五味子木脂素和MAFLD交集靶點共226個(見圖1).
圖1五味子與MAFLD的韋恩圖Fig.1Venn diagram of potential target of Schi- sandra chinensis and treating MAFLD
將226個交集靶點導入到String網絡中構建交集靶點網絡模型(見圖2).圖中共有222個節點、4636條邊，平均節點度值為41.8.圖3為根據度值排名構建PPI網絡的核心基因直方圖，結果提示，Akt1和PPAR-γ可能是五味子治療MAFLD的關鍵靶點.
圖2交集靶點的PPI網絡Fig.2Protein-protein interaction network of intersection target
圖3PPI網絡中的核心基因Fig.3Histogram of core genes in PPI network
圖4為成分與交集靶點之間的關系網絡圖，結合成分靶點預測結果，提示五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J和當歸酰戈米辛H是與Akt1較為密切的活性化合物；
五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J是與PPAR-γ較為密切的活性化合物，并在接下來的分子對接實驗中進行驗證.
圖4成分-交集靶點網絡Fig.4Component-intersection target network
在GO富集分析中，共獲取99個GO條目，其中生物過程(BP)條目42個(主要包括對脂蛋白顆粒的反應、細胞對脂蛋白顆粒刺激的反應、脂肪酸氧化的調節等)，細胞組成(CC)條目17個(主要包括睫狀基體、RNA聚合酶II轉錄因子復合物、核轉錄因子復合體等)，分子功能(MF)條目40個(主要包括蛋白磷酸酶結合、磷酸酶結合、DNA結合域等)(見圖5).在KEGG富集中，共獲得40條通路，主要涉及長壽調節途徑、AMPK信號通路、破骨細胞分化、癌癥通路等.最后將P值較小的前5個GO條目和前10個KEGG通路進行可視化分析(見圖6).
MF.分子功能；
CC.細胞組成；
BP.生物過程.圖5五味子活性成分治療咳嗽的GO富集分析Fig.5GO enrichment analysis of active components of Schisandra chinensis in treating cough
圖6關鍵靶點的KEGG通路富集分析Fig.6KEGG pathways enrichment analysis of key targets
2.2 分子對接模擬結果
分子對接結果顯示：Akt1和PPAR-γ與其對應成分的結合能均小于-5.0 kJ/mol(見表2)，表明成分與靶點具有較好的結合活性[8].然后將成分與靶點的對接結果在Pymol 1.8中進行可視化分析，結果見圖7.以五味子酯乙分別與Akt1和PPAR-γ靶點蛋白對接為例，分析其與受體之間可能存在的作用模式，五味子酯乙與活性位點附近的GLU-198、ASP-292、THR-160氨基酸殘基形成氫鍵結合到Akt1，與活性位點附近的SER-342氨基酸殘基形成氫鍵結合到PPAR-γ.
表2 五味子核心成分與關鍵靶點的對接能量Tab.2 Docking energy between key components of Schisandra chinensis and key targets
圖7與MAFLD相關的五味子核心木脂素與關鍵靶點的分子對接模式Fig.7Molecular docking pattern of key components of Schisandra chinensis and key targets related to MAFLD
隨著人們飲食結構、生活方式的改變，MAFLD的發病率逐年上升，并呈現低齡化趨勢，嚴重威脅人民的健康[9].肝臟作為機體物質代謝的中樞，主要涉及膽汁分泌、解毒排泄、生物代謝與轉化、凝血因子合成及免疫等多種重要的生物過程，其代謝轉化與吞噬解毒功能對機體有重要的保護作用[10].現代醫學主要通過保肝、降酶、降脂、調節免疫等方法治療MAFLD，但治療效果欠佳，存在停藥反彈現象，且不良反應大[11-12].中醫具有明顯的治療優勢，能為患者提供個性化治療方案，有效改善臨床癥狀[13].
在MAFLD的研究中，五味子總木脂素顯示出顯著的治療作用，不但能夠調節高脂動物模型的脂質代謝紊亂，還可以緩解肝臟炎癥損傷和脂質過氧化[14-16]，但具體的活性成分和作用機制則未能明確.本研究通過TCMSP平臺篩選12種SCL原型成分相關的1361個靶點，再利用TTD、DisGeNET和 DrugBank數據庫收集MAFLD相關靶點共627個.比對成分靶點與疾病靶點得到226個交集靶點，通過構建PPI網絡圖及拓撲分析進一步得到Akt1和PPAR-γ兩個關鍵靶點.成分靶點篩選和成分-靶點網絡圖結果顯示五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J和當歸酰戈米辛H可能是五味子治療MAFLD的核心成分.分子對接結果表明，核心成分與關鍵靶點之間對接緊密，具有較強的親和力.
有研究[17]表明，人體內許多基因、分子、信號通路等均與肝臟疾病的發生、發展密切相關.長壽調節途徑和AMPK信號通路是KEGG富集分析篩選得到的與MAFLD密切相關的信號通路，PI3K-Akt和NF-κB信號通路是其上游因子，而Akt1和PPAR-γ是這些通路中的重要因子.PI3K-Akt信號通路是經典的炎癥信號通路，可調節細胞分裂、分化、遷移等生理過程，具有促進細胞生存、細胞自噬及抗凋亡的作用[18].Akt1在肝臟中廣泛表達，但是肝臟中Akt1的過度抑制也可以誘發肝臟損傷[19-20].Akt1是AMPK的上游因子，能間接影響AMPK的表達.AMPK是一類重要的蛋白激酶，是細胞能量傳感器，在葡萄糖及脂肪酸代謝方面都起到了關鍵的作用.AMPK信號通路與MAFLD、2型糖尿病等代謝性疾病有關，它能調節葡萄糖和脂肪酸的代謝，ATP缺乏可導致AMPK磷酸化激活，從而能夠降低肝臟細胞脂肪含量，并減少甘油三酯的形成[21].PPAR-γ主要存在于免疫系統以及脂肪組織，能夠調節機體免疫、胰島素抵抗以及脂肪細胞分化[22].研究[23]表明，PPAR基因缺失可導致肝臟組織內脂質代謝發生紊亂，進而導致脂肪酸在肝臟組織內大量堆積，誘導肝臟組織發生脂肪變性，而PPAR-γ激活能減少大鼠骨骼肌內脂質積累及減輕脂肪肝模型小鼠的肝臟脂質積累，同時活化的PPAR-γ可以通過抑制NF-κB等轉錄因子的活性負向發揮轉錄調控的效應[24].在分子對接的驗證中發現，五味子核心成分能通過氫鍵緊密地結合相關靶點蛋白，表現出較強的親和力，提示五味子可能通過調控Akt1和PPAR-γ在信號通路中的表達以及炎癥、脂質代謝等多途徑發揮抗MAFLD的作用.
綜上，本研究通過網絡藥理學分析方法預測了五味子在肝臟中原型成分治療MAFLD的潛在靶點，探討了五味子可能通過多靶點、多通路來調節肝臟脂質代謝、炎癥反應等生物學過程，從而發揮治療作用.本研究還運用分子對接技術驗證了核心成分與關鍵靶點蛋白Akt1和PPAR-γ之間的結合活性，為后續進一步深入探究五味子治療MAFLD的藥理機制以及五味子藥用資源的合理開發利用提供科學依據.
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