劉艷霞，付生華，李想*，王駿飛，張恒，李寒，方正華，袁修堂，徐健，焦劍
生物技術(shù)
化肥連續(xù)施用條件下植煙土壤微生物群落響應(yīng)特征
劉艷霞1，付生華2，李想2*，王駿飛2，張恒1，李寒1，方正華3，袁修堂3，徐健2，焦劍2
1 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州省貴陽(yáng)市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號(hào) 550000；
2 中國(guó)煙草總公司貴州省公司，貴州省貴陽(yáng)市瑞金北路146號(hào) 550000；
3 福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廈門(mén)市思明區(qū)蓮岳路118號(hào) 361000
【目的】為探索土壤微生物對(duì)化肥連續(xù)施用的響應(yīng)特征。【方法】選擇煙草生產(chǎn)中常用的9種化學(xué)肥料，設(shè)置減少50%、常規(guī)施肥量和增加50%施用量3個(gè)肥料濃度梯度，采用土柱模擬系統(tǒng)結(jié)合微生物高通量測(cè)序、Biolog表型芯片等技術(shù)，研究長(zhǎng)期不同施肥處理?xiàng)l件下土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能基因、生態(tài)多樣性的變化情況，并構(gòu)建化肥與土壤微生物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。【結(jié)果】（1）連續(xù)施用9種化學(xué)肥料后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性中放線菌門(mén)（Actinobacteria）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）變化幅度較大，磷肥和復(fù)合肥增加放線菌門(mén)相對(duì)豐度，磷肥減少變形菌門(mén)相對(duì)豐度。（2）連續(xù)施肥條件下，尿素施用量減少50%處理的Shannon指數(shù)比初期增加1.77%，氯化鉀減少50%處理和常規(guī)施肥處理在初期明顯提高土壤微生物多樣性，后期Shannon指數(shù)略有下降，與不施肥空白對(duì)照之間無(wú)顯著差異，烤煙專(zhuān)用復(fù)合肥常規(guī)施肥處理Shannon指數(shù)后期較初期下降35.01%。（3）常規(guī)施肥濃度下鈣鎂磷肥處理的氨基酸與核苷酸運(yùn)輸和代謝基因表達(dá)較空白對(duì)照增多，氯化鉀處理的碳水化合物運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄功能、次生代謝產(chǎn)物合成基因明顯高于其他處理，硝酸鉀處理的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因表達(dá)要高于其他處理。（4）化肥對(duì)土壤微生物群落影響從高到低依次為硫酸鉀＞硝酸鉀＞復(fù)合肥料＞磷酸一銨＞硝酸銨＞普鈣＞氯化鉀＞鈣鎂磷肥＞尿素。【結(jié)論】不同種類(lèi)化肥連續(xù)施用均對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生不利影響，復(fù)合肥對(duì)土壤的沖擊作用大于單質(zhì)肥料，氯化鉀的施用對(duì)土壤微生物的不利影響程度較輕。
植煙土壤；
土柱模擬系統(tǒng)；
化肥；
微生物群落結(jié)構(gòu)；
功能基因；
關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)
煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。為追求經(jīng)濟(jì)利益，煙農(nóng)每年向土壤中投入大量化肥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)農(nóng)民對(duì)化肥的投資約占全部生產(chǎn)性支出的50%[2]。長(zhǎng)期不科學(xué)施用化肥會(huì)導(dǎo)致土壤中重金屬的積累[3]。另外，大量的營(yíng)養(yǎng)元素積累會(huì)造成土壤養(yǎng)分失衡、地下水位上升、次生鹽漬化和土壤板結(jié)的現(xiàn)象，甚至?xí)廴经h(huán)境[4]。化肥的大量、不合理施用，加之未合理補(bǔ)充有機(jī)質(zhì)導(dǎo)致土壤微生物群落失衡等問(wèn)題日趨嚴(yán)重[5-8]，土地生產(chǎn)能力下降[9-11]，進(jìn)而導(dǎo)致煙草產(chǎn)質(zhì)量下降[12-14]。
化肥的施用對(duì)根際微生物群落影響的研究有許多報(bào)道[15-17]。隨著化肥施用年限的增加，煙田土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)整體呈下降趨勢(shì)，土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量呈明顯下降趨勢(shì)[18]，根際微生物的多樣性越來(lái)越小，微生物類(lèi)群由“細(xì)菌型”向“真菌型”過(guò)渡，細(xì)菌/真菌比值下降，病原菌越來(lái)越積聚[19]。胡元森等[20]研究發(fā)現(xiàn)施用化肥連作3季后黃瓜連作引起土壤中細(xì)菌種群發(fā)生較大變化，其中噬菌弧菌（sp.）、假單胞菌（sp.）和另兩種不可培養(yǎng)細(xì)菌種群數(shù)量減少，而鞘氨醇單胞菌（sp.）和另外一種不可培養(yǎng)細(xì)菌種群數(shù)量增加。Ling等[21]研究發(fā)現(xiàn)4年施用化肥連作后西瓜根際細(xì)菌的多樣性下降，連作后微生物優(yōu)勢(shì)種群為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)，隨連作年限增加，3種優(yōu)勢(shì)微生物數(shù)量增多，占全部微生物群落的比例增大，導(dǎo)致微生物群落不平衡[22]。
長(zhǎng)期定位試驗(yàn)是研究不同施肥處理對(duì)土壤長(zhǎng)遠(yuǎn)影響不可替代的研究手段[23]。然而，由于長(zhǎng)期定位試驗(yàn)時(shí)間跨度大，很難保證定時(shí)定點(diǎn)取樣檢測(cè)，且田間試驗(yàn)受到當(dāng)年氣候、農(nóng)事操作等外界因素的影響，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)大、不穩(wěn)定，為研究土壤動(dòng)態(tài)變化帶來(lái)一定的困難。因此，設(shè)計(jì)一種更為簡(jiǎn)便、高效的方法模擬研究長(zhǎng)期、大量施用化肥對(duì)土壤微生物帶來(lái)的沖擊作用，成為現(xiàn)實(shí)需要。自從H. Jenny提出“生態(tài)樣塊”學(xué)說(shuō)以來(lái)，伴隨著實(shí)驗(yàn)土壤學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)可以取一定的土壤胞體代表土壤系統(tǒng)，用以研究系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)及作物生長(zhǎng)的情況，這種方法被稱(chēng)為“土柱試驗(yàn)”[24]。目前，土柱試驗(yàn)最適用于水田土壤系統(tǒng)的研究，一般在營(yíng)養(yǎng)元素淋溶[25]與重金屬遷移[26]等研究中廣泛應(yīng)用，未見(jiàn)其在土壤微生物研究領(lǐng)域的報(bào)道。
本研究從長(zhǎng)期定位田間不同施肥處理導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量和土壤性狀差異的現(xiàn)象出發(fā)，提出假設(shè)：不同化學(xué)肥料對(duì)土壤微生物影響差異較大，進(jìn)而設(shè)計(jì)室內(nèi)土柱模擬試驗(yàn)，分析9種化肥、3個(gè)濃度連續(xù)施用下土壤微生物的響應(yīng)特征，旨在短時(shí)期內(nèi)反映化肥對(duì)土壤的持續(xù)沖擊作用，探索長(zhǎng)期不科學(xué)施用化肥條件下土壤微生物群落的響應(yīng)機(jī)制，以期為化肥的科學(xué)施用提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 供試土壤與肥料
供試土壤為黃壤，質(zhì)地為重壤土。于2020年取自貴州省煙草科學(xué)研究院煙草土壤肥力與肥料效益長(zhǎng)期定位試驗(yàn)站（106°07"57. 6″ N, 26°11"34. 5″ E）。供試土壤pH 5.45，有機(jī)質(zhì)48.6 g/kg，全氮2.29 g/kg，堿解氮158 mg/kg，速效磷48.9 mg/kg，速效鉀543 mg/kg。
供試肥料種類(lèi)如下：
化學(xué)氮肥：尿素(NH2)2CO（AR）、NH4NO3（AR）；
化學(xué)磷肥：鈣鎂磷肥(P2O5=14.62%)、普鈣（P2O5=13.28%）；
化學(xué)鉀肥：K2SO4（AR）、KCl（AR）；
化學(xué)復(fù)合肥：NH4H2PO4（AR）、KNO3（AR）、烤煙專(zhuān)用復(fù)合肥(N:P2O5:K2O=10:10:20）。
1.2 模擬研究連續(xù)施用不同化肥對(duì)土壤微生物群落的影響
1.2.1 土柱模擬系統(tǒng)
采用高30 cm直徑7.5 cm的 PVC管作為土柱容器（圖1），采用塑料薄膜封閉一端，另一端用無(wú)菌透氣封口膜密封，橡皮筋扎緊；
將休耕土壤粉碎過(guò)6目篩并混勻，將土壤水分含量調(diào)至土壤持水量65%；
每個(gè)土柱裝土2 kg，將土柱隨機(jī)放入人工氣候箱（型號(hào)：RGL-P1000D）中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)箱濕度設(shè)為65%，溫度設(shè)為25℃。
圖1 土柱施肥模擬系統(tǒng)
1.2.2 土柱模擬系統(tǒng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)
以煙草土壤肥力與肥料效益長(zhǎng)期定位試驗(yàn)實(shí)際施肥量為依據(jù)，化學(xué)氮肥處理各處理常規(guī)施用N量為5g/柱/次，化學(xué)磷肥各處理施用P2O5量為5g/柱/次，化學(xué)鉀肥各處理施用K2O為10g/柱/次，化學(xué)復(fù)合肥處理按照等氮量5g/柱/次計(jì)算，在此基礎(chǔ)上計(jì)算減施50%與增施50%處理肥料施用量。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：設(shè)置9種化學(xué)肥料處理和1個(gè)空白對(duì)照（CK）（表1），各處理設(shè)置3個(gè)施肥量，即：T1減施化肥50%、T2常規(guī)施肥水平、T3增施化肥50%，每次每土柱肥料施用量詳見(jiàn)表1。空白對(duì)照不加肥料，但與處理間補(bǔ)齊水分。各處理重復(fù)5次。
表1 土柱模擬試驗(yàn)不同化肥種類(lèi)和施用量
Tab.1 Application amount of various chemical fertilizers in soil column simulation system
施肥方法：每隔20 d進(jìn)行1次施肥和補(bǔ)水，每次施肥量一致，共進(jìn)行5次施肥和補(bǔ)水，在進(jìn)行補(bǔ)水和施肥之前檢測(cè)土壤的水分含量（用稱(chēng)重法）以確定補(bǔ)水量，確保每次補(bǔ)水后土壤水分含量保持一致。每次施肥時(shí)，將土柱內(nèi)土壤倒出，將計(jì)算好用量的肥料（提前磨成粉狀）和水均勻拌入土中，分級(jí)拌入以保證均勻度，完成后再裝入土柱。
取樣方法：研究化肥對(duì)土壤的瞬時(shí)影響，以及化肥施用后土壤隨時(shí)間變化具有的緩沖作用和自我恢復(fù)功能。于第一次補(bǔ)水前進(jìn)行1次取樣（20 d樣品），用于研究化肥施用后對(duì)土壤的瞬時(shí)影響。施肥5次后不再施肥，最終在300 d再次取樣（300 d樣品），用于研究化肥連續(xù)施用后，土壤在緩沖作用下對(duì)化肥的響應(yīng)特征。
1.2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及功能基因代謝測(cè)定
對(duì)300 d土壤DNA采用Soil DNA Isolation Kit（Omega）提取，土壤DNA提取物采用無(wú)菌水稀釋至1×10-3μg/μL。以DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物為515F-806R，引物采用515F：5’-GTGYCAGCMGCCGC GGTAA-3’和806R：5’-GGACTACNVGGGTWTCTAA- 3’。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用GeneJET 膠回收試盒（Thermo Scientific）回收產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系以及文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析參見(jiàn)文獻(xiàn)[27]。基于宏基因組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)采用PICRUSt (phylogenetic investigation of communities by the reconstruction of unobserved states )（https://github. com/picrust/picrust）預(yù)測(cè)菌群可能參與的代謝通路[28]。
1.2.4 土壤細(xì)菌群落生態(tài)多樣性測(cè)定
根際土壤微生物生態(tài)多樣性對(duì)20d和300d的土壤采用Biolog EcoPlate系統(tǒng)（Biolog Inc. Hayward Cal. USA）比較31種碳源利用情況。土壤懸液在4℃、3000g轉(zhuǎn)速下離心5 min，然后用0.85%的NaCl溶液稀釋100倍。土壤稀釋液接種于EcoPlates，在Biolog恒溫（25℃）培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)72 h。微生物活性用微孔板平均顏色變化度（AWCD）值表示，Shannon指數(shù)指征土壤微生物生態(tài)多樣性[29]。
Shannon Index=-Σln
其中，P=Ai/Atotal，代表第i孔相對(duì)吸光度值與整個(gè)平板相對(duì)吸光度總和的比率，A代表590 nm處吸光度。
Biolog含有31種碳源，根據(jù)官能團(tuán)分為6大類(lèi)，其中碳水化合物7種，氨基酸6種，羧酸9種，聚合物4種，胺類(lèi)2種，其他化合物3種。計(jì)算300 d土壤樣品中的微生物對(duì)不同種類(lèi)碳源的相對(duì)利用率，用Biolog微孔板平均顏色變化率（）表示。
式中：A為反應(yīng)孔吸光值；
n為碳源數(shù)。
1.3 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016處理，顯著性分析采用SPSS Base Ver.13.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS, IL, Chicago, 美國(guó)）進(jìn)行，最小顯著差異法（LSD）或鄧肯（Duncan）新復(fù)極差進(jìn)行多重比較（<0.05）。
以施肥為源結(jié)點(diǎn)、以運(yùn)算的分類(lèi)單位（operational taxonomic unit，OTU）為目標(biāo)結(jié)點(diǎn)生成二分圖，即結(jié)點(diǎn)連接線表示特定OTU與特定施肥或施肥組合的正關(guān)聯(lián)[30]。在Cytoscape（https://cytoscape.org/）中使用邊緣加權(quán)spring嵌套對(duì)象布局算法生成二分圖，并根據(jù)關(guān)聯(lián)強(qiáng)度對(duì)邊緣進(jìn)行加權(quán)。使用Spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算分析所有顯著（<0.05）相關(guān)OTU對(duì)之間的OTU互相關(guān)。基于此信息，在Cytoscape中使用邊緣加權(quán)spring嵌套對(duì)象布局算法構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)相關(guān)系數(shù)對(duì)邊緣進(jìn)行加權(quán)。
2.1 土柱模擬條件下不同種類(lèi)化肥處理對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響
尿素減少50%施用量、常規(guī)施用量、增加50%施用量處理的放線菌門(mén)相對(duì)豐度較空白對(duì)照（CK）分別減少25.65%、20.06%和3.73%（圖2a），相對(duì)豐度隨尿素施肥量提高而增加；
尿素減少50%施用量、常規(guī)施用量、增加50%施用量處理的厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度分別是空白對(duì)照（CK）處理的117.1、85.8、和35.4倍，尿素促進(jìn)土壤厚壁菌門(mén)生長(zhǎng)，但是隨著施肥量升高促進(jìn)作用減弱，尿素處理對(duì)其他微生物相對(duì)豐度均有抑制作用；
硝酸銨處理的硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、變形菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）相對(duì)豐度隨著施肥量提高而增加，綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）和浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）的相對(duì)豐度減少。
鈣鎂磷肥處理和普鈣處理的放線菌門(mén)相對(duì)豐度比空白對(duì)照分別增加47.25%和53.27%（圖2b），而且與施肥量呈正相關(guān)關(guān)系；
變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)則呈相反趨勢(shì)；
兩種磷肥不同濃度的綠彎菌門(mén)豐度雖與空白對(duì)照相近，但OTU總量要明顯高于空白對(duì)照。
硫酸鉀減少50%施用量、常規(guī)施用量、增加50%施用量處理的放線菌門(mén)相對(duì)豐度分別比空白對(duì)照增加6.98%、14.95%、17.64%（圖2c），隨著硫酸鉀施肥量的提高，3種不同施肥量處理變形菌門(mén)相對(duì)豐度小于或與空白對(duì)照相當(dāng)，硫酸鉀不同施肥量處理之間厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度差異并不顯著，OTU總量高于空白對(duì)照。隨著氯化鉀施肥量增加，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和浮霉菌門(mén)相對(duì)豐度呈增加趨勢(shì)。
復(fù)合肥處理對(duì)放線菌門(mén)的促進(jìn)作用排序依次為磷酸一銨>烤煙專(zhuān)用復(fù)合肥>硝酸鉀（圖2d）；
磷酸一銨和烤煙專(zhuān)用復(fù)合肥對(duì)變形菌門(mén)抑制作用明顯，而硝酸鉀處理對(duì)其有促進(jìn)作用，硝酸鉀各梯度處理較空白對(duì)照（CK）處理分別提高3.71%、10.15%和7.47%；
3種復(fù)合肥處理對(duì)酸桿菌門(mén)具有明顯的抑制作用，抑制作用依次為磷酸一銨>烤煙專(zhuān)用復(fù)合肥>硝酸鉀；
磷酸一銨和硝酸鉀處理對(duì)綠彎菌門(mén)具有抑制作用；
硝酸鉀和烤煙專(zhuān)用復(fù)合肥處理對(duì)厚壁菌門(mén)其有促進(jìn)作用而磷酸一銨具有抑制作用。
注：a-不同施肥量氮肥；
b-不同施肥量磷肥；
c-不同施肥量鉀肥；
d-不同施肥量復(fù)合肥。
2.2 土柱模擬條件下不同種類(lèi)化肥處理對(duì)土壤細(xì)菌群落生態(tài)多樣性的影響
在20 d的土壤樣品中，氯化鉀和硝酸鉀施用量減少50%處理的Shannon指數(shù)之間無(wú)顯著差異，均顯著高于空白對(duì)照，分別增加了5.90%和3.39%，其余化肥處理均顯著低于空白對(duì)照；
氯化鉀和硝酸鉀常規(guī)施用量處理的Shannon指數(shù)與空白對(duì)照之間無(wú)顯著差異，硫酸鉀與硝酸鉀施用量增加50%處理的Shannon指數(shù)之間無(wú)顯著差異均顯著高于空白對(duì)照，分別增加了6.78%和5.01%；
尿素和硝酸銨處理與空白對(duì)照之間無(wú)顯著差異。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期不同種類(lèi)化肥施用后（300 d樣品）的土壤，尿素和氯化鉀施用量減少50%處理的Shannon指數(shù)均小于空白對(duì)照，但兩處理之間無(wú)顯著差異；
氯化鉀常規(guī)施用量處理的Shannon指數(shù)與空白對(duì)照之間無(wú)顯著差異；
所有化肥施用量增加50%處理的Shannon指數(shù)均顯著小于空白對(duì)照，其中磷酸一銨和尿素僅為空白對(duì)照的57.14%和59.91%。
由圖3可以看出，空白對(duì)照中土壤微生物對(duì)羧酸類(lèi)和聚合物的利用率顯著高于化肥處理，對(duì)碳水化合物的利用略高于尿素和烤煙專(zhuān)用復(fù)合肥，但比其它化肥顯著降低41.9%～50.0%。除尿素外，其他單質(zhì)肥料與復(fù)合肥相比，土壤微生物對(duì)碳水化合物的利用率都顯著提高。使用含氮肥料后土壤微生物對(duì)氨基酸類(lèi)物質(zhì)的利用率顯著低于不含氮化肥，而對(duì)羧酸類(lèi)物質(zhì)利用的趨勢(shì)與對(duì)氨基酸類(lèi)物質(zhì)利用效率相反，單質(zhì)肥料比復(fù)合肥相比顯著減少對(duì)羧酸類(lèi)物質(zhì)利用，減少最多的為硝酸鉀，其比復(fù)合肥對(duì)羧酸利用率減少22.2%。結(jié)果表明，不同種類(lèi)的化肥連續(xù)施用導(dǎo)致土壤微生物的代謝功能發(fā)生了變化。
表2 不同種類(lèi)化肥處理對(duì)土壤細(xì)菌群落生態(tài)多樣性的影響（Shannon多樣性指數(shù)）
注：平均值多重比較采用One-way ANOVA Duncan法，數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同的小寫(xiě)字母表示處理間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。
Note: Data is expressed as means±s.d.(n=3) and multiple comparison was performed using One-way ANOVA Duncan method. Different lowercase letters indicate that difference is of statistical significance at<0.05.
圖3 不同種類(lèi)化肥施用條件下土壤微生物群落對(duì)Biolog 6類(lèi)碳源的相對(duì)利用率
2.3 土柱模擬條件下不同種類(lèi)化肥處理對(duì)土壤細(xì)菌群落代謝基因的影響
對(duì)長(zhǎng)期施用不同種類(lèi)化肥常規(guī)施用量下的土壤微生物代謝基因的變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖4），鈣鎂磷肥處理的氨基酸與核苷酸運(yùn)輸代謝基因表達(dá)較空白對(duì)照分別上調(diào)89.5%和86.4%；
氯化鉀處理的碳水化合物運(yùn)輸和代謝基因顯著高于其他處理，比空白對(duì)照增加74.6%；
硝酸鉀處理的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因表達(dá)高于其他處理，比空白對(duì)照增加16.5%；
所有處理間其他代謝基因表達(dá)與空白對(duì)照之間無(wú)明顯差異。
注：A-尿素；
B-硝酸銨；
C-復(fù)合肥；
D-鈣鎂磷肥；
E-普鈣；
F:磷酸一銨；
H：硫酸鉀；
M-氯化鉀；
N-硝酸鉀；
CK-空白對(duì)照。
2.4 不同種類(lèi)化肥處理對(duì)土壤細(xì)菌群落相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的影響
使用雙向關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)（bipartite association network）對(duì)OTU與不同施肥措施之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行可視化構(gòu)建，結(jié)果表明（圖5），9481個(gè)重要OTU的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度（即度中心，指OTU與其它微生物建立連接的數(shù)量）大小為0.202～0.346。在這些OTU中，有54.23%與硫酸鉀施用密切相關(guān)，只有34.13%與復(fù)合肥料相關(guān)，證實(shí)了不同施肥措施對(duì)微生物群落影響的差異。加權(quán)程度表示施肥重要性，從高到低依次為硫酸鉀＞硝酸鉀＞復(fù)合肥料＞磷酸一銨＞硝酸銨＞普鈣＞氯化鉀＞鈣鎂磷肥＞尿素＞空白對(duì)照。在關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的三個(gè)維度上，氯化鉀、硝酸鉀和硝酸銨之間的空間關(guān)系緊密，而復(fù)合肥與空白對(duì)照的空間關(guān)系相對(duì)緊密。在另一個(gè)集群中，除了磷酸一銨之外，包括尿素，硫酸鉀和過(guò)普鈣在內(nèi)的單質(zhì)化學(xué)肥料也屬于同一聚類(lèi)簇（一個(gè)數(shù)據(jù)集里的一組點(diǎn)）。
注：A-尿素；
B-硝酸銨；
C-復(fù)合肥；
D-鈣鎂磷肥；
E-普鈣；
F:磷酸一銨；
H：硫酸鉀；
M-氯化鉀；
N-硝酸鉀；
CK-空白對(duì)照。
長(zhǎng)期不同的施肥處理對(duì)根際微生物影響的研究較多[5, 15, 21]，但長(zhǎng)期定位試驗(yàn)需要時(shí)間跨度較大，煙草的連作障礙問(wèn)題導(dǎo)致許多植煙土壤定位試驗(yàn)不足5年就面臨報(bào)廢的境地，目前貴州省植煙土壤長(zhǎng)期定位持續(xù)15年的肥料效益評(píng)價(jià)試驗(yàn)仍在開(kāi)展，主要通過(guò)煙草-玉米輪作方式來(lái)解決煙草連作障礙問(wèn)題。對(duì)于長(zhǎng)期不科學(xué)施用化肥且不輪作處理下植煙土壤酶活性變化、土壤微生物活性的變化及發(fā)展趨勢(shì)等還缺乏深入的研究。本研究采用室內(nèi)模擬植煙土壤長(zhǎng)期不同化肥處理，研究土壤微生物群落變化，化肥種類(lèi)、濃度均參照田間實(shí)際生產(chǎn)，且研究過(guò)程不受氣候、地型、農(nóng)事操作等影響，研究結(jié)果具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。
長(zhǎng)期使用不同的化肥對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響顯著不同。在本研究中尿素、硫酸鉀、磷肥（鈣鎂磷肥、普鈣）和磷酸一銨隨著施肥量的增加提高放線菌門(mén)相對(duì)豐度，氯化鉀、烤煙專(zhuān)用復(fù)合肥和硝態(tài)氮肥（硝酸銨和硝酸鉀）隨施肥量的增加降低放線菌門(mén)相對(duì)豐度，高量氮肥的施用導(dǎo)致放線菌門(mén)受到抑制[31]。變形菌門(mén)相對(duì)豐度僅次于放線菌門(mén)；
尿素和含磷肥料處理下的變形菌門(mén)較空白對(duì)照低，除鈣鎂磷肥和硫酸鉀，變形菌門(mén)OTU總數(shù)與施肥量呈正相關(guān)，變形菌門(mén)相對(duì)豐度高低排序?yàn)殁浄?含銨態(tài)氮的肥料>磷肥。Zhao等[32]研究長(zhǎng)期定位條件下不同耕作方式微生物區(qū)系差異，發(fā)現(xiàn)土壤微生物中α-Proteobacteria與速效K含量成極顯著正相關(guān)、與總氮成負(fù)相關(guān)、與有效磷成顯著負(fù)相關(guān)，與本研究中不同肥料類(lèi)型變形菌門(mén)變化趨勢(shì)相同。厚壁菌門(mén)大多數(shù)細(xì)菌具有極強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)性，在極端生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮重要作用[33]，不同種類(lèi)肥料處理下厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度排序?yàn)楹@態(tài)氮的肥料>鉀肥>磷肥。Marina等[34]也研究發(fā)現(xiàn)在幾乎無(wú)法培養(yǎng)微生物的礦渣中添加一定量的氮營(yíng)養(yǎng)后，厚壁菌門(mén)數(shù)量得到增加。酸桿菌門(mén)主要降解動(dòng)植物殘?bào)w以及參與鐵載體的循環(huán)，促進(jìn)植物誘導(dǎo)抗性反應(yīng)[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同肥料對(duì)酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度排序?yàn)殁浄?含硝態(tài)氮的肥料>磷肥>含銨態(tài)氮的肥料，此結(jié)果與Zhao等[32]研究長(zhǎng)期定位條件下不同耕作方式微生物區(qū)系差異的結(jié)果相似，即酸桿菌門(mén)受速效鉀含量影響。
Shannon指數(shù)是表征微生物群落多樣性的重要指標(biāo)。本研究中，除氯化鉀外的其它化肥無(wú)論是減量、常規(guī)還是增量處理，長(zhǎng)期施用后土壤微生物群落多樣性都顯著低于空白對(duì)照，表明長(zhǎng)期施用化肥會(huì)破壞微生物生態(tài)系統(tǒng)的平衡。長(zhǎng)期施肥條件下尿素施用量減少50%處理Shannon指數(shù)比初期增加1.77%，氯化鉀減少50%處理和常規(guī)用量處理在初期明顯提高土壤微生物多樣性，在長(zhǎng)期施肥條件下Shannon指數(shù)略有下降，但與空白對(duì)照之間無(wú)顯著差異。前人研究發(fā)現(xiàn)扁豆和甜瓜根際單施尿素條件下微生物群落多樣性也會(huì)略有提高[36-37]。郭帥等[38]研究發(fā)現(xiàn)尿素+氯化鉀處理的氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的基因豐度均較高（0.05）。綜合比較不同處理氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的DGGE條帶的多樣性以及定量分析得出結(jié)論，尿素+氯化鉀處理的氨氧化微生物多樣性和功能基因最豐富，建議生產(chǎn)上采用尿素與氯化鉀搭配施，有利于土壤氨氧化微生物的活動(dòng)和氮素循環(huán)利用。劉曉燕等[39]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用氯化鉀顯著影響玉米生育前期根際土壤真菌和放線菌數(shù)量，對(duì)根際土壤細(xì)菌數(shù)量影響不明顯。另有研究表明施用含氯化鉀的肥料顯著影響土壤微生物的組成及數(shù)量，其中G+細(xì)菌顯著降低，真菌和放線菌數(shù)量變化不大[40]，這主要是由于該研究在稻-麥輪作體系中氯化鉀長(zhǎng)期施用，厭氧-好氧轉(zhuǎn)換下的土壤氧化還原反應(yīng)劇烈，進(jìn)而抑制了土壤氨氧化能力、硝化能力[41]。
本研究發(fā)現(xiàn)9種化肥中只有鈣鎂磷肥、氯化鉀和硝酸鉀處理的代謝基因高于空白對(duì)照，鈣鎂磷肥的氨基酸與核苷酸運(yùn)輸和代謝基因表達(dá)增多，可以用來(lái)改善土壤微生物氮素循環(huán)[42]，而氯化鉀處理的碳水化合物運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄功能基因、次生代謝產(chǎn)物合成基因顯著高于其他處理，上述基因與土壤微生物碳代謝有著密不可分的聯(lián)系[43]。迄今為止，研究較多的功能基因多與碳、氮等元素的物質(zhì)循環(huán)過(guò)程相關(guān)，其它生態(tài)過(guò)程（例如磷循環(huán)）還沒(méi)有相關(guān)的功能基因研究結(jié)果，仍值得進(jìn)一步深入探討[44]。
本研究未對(duì)所有具有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果進(jìn)行全面討論，重點(diǎn)研究了施肥后土壤微生物最顯著影響，例如微生物的結(jié)構(gòu)和功能以及互相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，主要采用“三步法”策略來(lái)檢索土壤微生物對(duì)不同施肥的反應(yīng)的信息。首先檢測(cè)了門(mén)水平上，不同肥料的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；
然后預(yù)測(cè)了不同肥料之間代謝基因的調(diào)控；
最后闡明了微生物與不同施肥之間的相互作用和相關(guān)性。此種研究策略既聚焦微生物種類(lèi)與功能對(duì)肥料連續(xù)施用的響應(yīng)，又重點(diǎn)關(guān)注微生物種間復(fù)雜的關(guān)聯(lián)關(guān)系，為土壤微生物作用整體發(fā)揮提供技術(shù)支持。
土壤微生物活性是土壤肥力的重要指標(biāo)，不同種類(lèi)化肥長(zhǎng)期施用均對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生不利影響，氯化鉀的施用對(duì)土壤微生物的不利影響程度較小，尿素、鈣鎂磷肥以及氯化鉀的施用可以調(diào)節(jié)土壤微生物代謝基因的表達(dá)。不同種類(lèi)化肥連續(xù)施用均對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生不利影響，影響從高到低依次為硫酸鉀＞硝酸鉀＞復(fù)合肥料＞磷酸一銨＞硝酸銨＞普鈣＞氯化鉀＞鈣鎂磷肥＞尿素，表明復(fù)合肥料的影響大于單質(zhì)化學(xué)肥料的影響。
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Response characteristics of microbial community structure in tobacco-planting soil under repeated application of chemical fertilizers
LIU Yanxia1, FU Shenghua2, LI Xiang2*, WANG Junfei2, ZHANG Heng1, LI Han1, FANG Zhenghua3, YUAN Xiutang3, XU Jian2, JIAO Jian2
1 Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550000, China;2 Guizhou Tobacco Company, Guiyang 550000, China;3 China Tobacco Fujian Industrial Co., Ltd., Xiamen 361000, China
This study aims to explore the response characteristic of soil microorganisms to repeated application of chemical fertilizers.In this paper, experiments were conducted by using nine kinds of commonly used chemical fertilizers under three fertilizing gradients (50% fertilizing amount, conventional application amount and 150% fertilizing amount) using soil column simulation system combined with microbial high-throughput sequencing, Biolog phenotype chip technology, in order to study the changes of soil microbial community structure, functional genes and ecological diversity under repeated application of different fertilizers and establish the association network between fertilizer and soil microorganisms.The results show that (1) the diversities of Actinobacteria and Proteobacteria dramatically changed after repeated application of 9 chemical fertilizers. Phosphate and compound fertilizers increased the relative abundance of Actinobacteria, while phosphate reduced the relative abundance of Proteobacteria. (2) At 50% fertilizing amount of urea, the Shannon index increased by 1.77% compared with the initial stage. The application of potassium chloride with 50% fertilizing amount and normal fertilizing amount obviously increased soil microbial diversity at the initial stage, but the Shannon index decreased slightly at the later stage, showing no significant difference with that of CK. The Shannon index of compound fertilizer specific for flue-cured tobacco under normal fertilizing amount decreased by 35.01% in the later period. (3) The expression of amino acid and nucleotide transport and metabolism genes of calcium-magnesium phosphate fertilizer under normal fertilizing amount were up-regulated compared with CK. The expressions of functional genes of carbohydrate transport and metabolism, transcription, secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism of potassium chloride treatment were significantly higher than other treatments. The expression of lipid transport and metabolism gene of potassium nitrate was the highest among treatments. (4) The effect of chemical fertilizers on soil microbial community from high to low was potassium sulphate> potassium nitrate> compound fertilizer> monoammonium phosphate> ammonium nitrate> calcium superphosphate> potassium chloride> calcium magnesium phosphate> urea.In summary, the repeated application of different chemical fertilizers will negatively affect soil microbial community. Compound fertilizers have greater impact than single chemical fertilizer. Moreover, the application of potassium chloride has less negative impact on soil microorganisms.
tobacco-planting soil; soil column simulation system; chemical fertilizer; microbial community structure; functional gene; co-correlation networks
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劉艷霞，付生華，李想，等. 化肥連續(xù)施用條件下植煙土壤微生物群落響應(yīng)特征[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2022，28（6）. LIU Yanxia, FU Shenghua, LI Xiang, et al. Response characteristics of microbial community structure in tobacco-planting soil under repeated application of chemical fertilizers[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(6).doi:10.16472/j.chinatobacco.2022.011
國(guó)家自然科學(xué)基金“連作條件下導(dǎo)病抑病型植煙土壤根際微生物群落演替及生物修復(fù)”（31860597）；
院士工作站（黔科合平臺(tái)人才[2020]4004）；
中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目“根際增氧技術(shù)促進(jìn)有機(jī)肥養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的研究與應(yīng)用”（201905）；
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劉艷霞（1982—），博士，副研究員，主要研究方向?yàn)橹矡熗寥辣Ｓ巴羵鞑『ι?a href="http://www.cnyhmy.com/doc/fangkong/" target="_blank" class="keylink">防控，Tel：0851-84116909，Email：liuyanxia306@163.com
李想（1982—），Tel：18685188016，Email：newcool1361214@163.com
2022-01-25；
2022-08-16
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