姜冉冉 江潤海 朱城強 侯秀麗
關鍵詞：狗牙根；
乙二胺四乙酸（EDTA）；
抗氧化酶系統；
植物鉛富集；
土壤磷、鉛形態
隨著社會經濟的發展，土壤重金屬污染已成為全球關注的生態環境問題之一，在工業密集區域、重金屬礦開采區域重金屬污染加重。因重金屬在土壤中具有不易降解和持久性的特點，會對生物圈構成前所未有的威脅。其中鉛（Pb）是一種有毒重金屬，對動物、植物和微生物的危害較大。目前重金屬污染土壤的植物修復技術主要分為植物提取、植物固定、植物揮發和根際過濾。植物修復技術具有成本低、綠色安全、對原生環境破壞小且兼具環境美學等特點。近年來，草坪草在土壤重金屬修復工作中發揮了重要的成效，從國內外研究現狀來看，草坪植物的修復作用越發引人關注。如國內外廣泛栽培的多花黑麥草對鋅、鎘和鉛都有明顯的富集效果，馬蹄金和白三葉在草坪綠化中運用較多，不僅抗病、抗污染能力較強，同時對土壤重金屬鉛具有一定的富集能力。陳明君等認為狗牙根能夠明顯降低江水中的銅、鉛和鋅含量。但植物修復技術因受到多重環境污染和植物特性不同的影響，在具體實踐中具有一定的局限性。因此可利用螯合劑一植物聯合修復技術，螯合劑能促進土壤中重金屬的溶解，改變重金屬在土壤中的存在形態，形成水溶性螯合物，提高重金屬的生物有效性，增加重金屬在植物地上部的積累，螯合劑一植物修復作為一種經濟環保的修復技術，具有良好的應用前景。
乙二胺四乙酸（EDTA）螯合劑因去除重金屬效率較高而被廣泛應用于土壤重金屬污染修復。有研究表明EDTA能增強植物對鉛的吸收，可誘導重金屬從礦物質中解吸，并促進土壤中重金屬鉛從根向地上部的轉移。在印度芥菜中發現螯合物輔助莖的鉛積累量增加100～200倍，而在豌豆和玉米中重金屬積累有多倍的增加。Kirkham指出當向日葵生長在受污水污泥污染的土壤中時，地上部鉛含量顯著增加。螯合劑不僅促進鉛的吸收和轉運，而且保護植物免受重金屬暴露產生的氧化應激。而施加EDTA是否能提高狗牙根對重金屬耐性的機制研究目前尚未見報道。因此本試驗探究了重金屬鉛脅迫下施加不同濃度EDTA對狗牙根生理特性、鉛的吸收轉運及根際土壤磷、鉛形態的變化機制，以期為重金屬鉛污染土壤的修復以及植被恢復或綠地規劃提供理論依據。
1材料與方法
1.1試驗材料及設計
試驗于2021年8月在昆明學院溫室大棚進行。采用盆栽試驗，設置0（CK）、2.5、5、7.5、10mmol/L共5個EDTA濃度處理，每處理重復3次。
根據云南省蘭坪縣鉛鋅礦區土地利用類型中的開采礦區鉛含量范圍106.4～738.74mg/kg，設置土壤鉛污染濃度。供試土壤為云南省昆明市紅土與腐殖土，1：1混合備用稱為原土：原土添加重金屬鉛（PbC03）500mg/kg充分混勻，螯合2個月，模擬鉛污染土壤稱為鉛螯合土壤。原土與鉛螯合土壤基本理化性質如表1所示。塑料盆規格為25cm（直徑）×17cm（高），裝土2.5kg（干重），盆下帶托盤。供試植物為多年生狗牙根（Cynodon dactylon L），每盆100粒（以保證發芽后每盆大于70株）。溫室晝／夜溫度為25/15℃，每兩天澆一次水，以保持土壤含水率為最大持水量的70%，水不滲出托盤。播種后第30天和第45天直接以溶液形式分別向土壤中施加不同濃度的EDTA，每次施加量為50mL，第60天收獲狗牙根。
1.2測定指標及方法
1.2.1植物樣品采集及測定于收獲期采集狗牙根樣品，去除根部大塊土壤，置于冰上運輸至實驗室，用去離子水沖洗，吸水紙吸干表面水分。一部分狗牙根樣品用于生理指標的測定，狗牙根葉片、根系的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量測定均參照南京建成生物工程研究所提供試劑盒進行。另一部分狗牙根樣品于70℃條件下殺青，置于烘箱內烘至恒重，取出后將狗牙根地上部和根系樣品粉碎，采用混合酸（硝酸：過氧化氫=4：1）消解，過濾定容，用于測定地上部及根系鉛含量。
狗牙根對重金屬鉛的轉移能力用轉移系數（TF）表示，計算方法為狗牙根地上部鉛含量與根部鉛含量比值。
1.2.2土壤樣品采集及測定取出狗牙根后晃動根部，去除松散的土壤后，使用無菌刷從根部收集殘留在其上的土壤。土壤樣品經自然風干，去除石礫、有機殘體、植物根系等，過0.149mm篩后分別用于測定不同形態磷、鉛含量。不同形態磷測定采用張守敬提出的連續提取法，分為Al-P（鋁結合態磷酸鹽）、Fe-P（鐵結合態磷酸鹽）、0-P（閉蓄態磷酸鹽）、Ca-P（鈣結合態磷酸鹽），利用不同化學浸提劑的特性，將土壤中各種形態的無機磷酸鹽逐級分離，再利用鉬銻抗比色法測定。土壤各形態鉛含量測定采用中國地質局提出的七步提取法，采用ICP-MS，根據在土壤各相中的分布及其結合特點，一般可將土壤中的鉛分為水溶態、離子交換態、碳酸鹽結合態、腐殖酸結合態、鐵錳氧化態、強有機結合態以及殘渣態。前3種鉛形態穩定性差，但僅占土壤中鉛總量的少部分，后4種鉛形態穩定性強占大部分。土壤重金屬鉛污染主要來源于前3種不穩定形態鉛，該形態鉛易被植物吸收，歸為有效態。
1.3數據處理與分析
試驗數據采用Microsoft Excel 2010進行統計整理，SPSS 22.0進行單因素分析（ANOVA-Test）及差異顯著性檢驗，Origin 2018制圖。
2結果與分析
2.1不同濃度EDTA對重金屬鉛脅迫下狗牙根抗氧化酶系統指標的影響
不同濃度EDTA對重金屬鉛脅迫下狗牙根葉片、根系SOD活性的影響如圖1A所示。隨著EDTA濃度的增加狗牙根葉片、根系SOD活性呈現先上升后下降的趨勢，且葉片>根系，說明葉片受到脅迫后產生的氧化應激反應高于根系。ED-TA施用濃度為5mmol/L時，狗牙根葉片、根系SOD活性最高，分別為173.77、158.65U/mg prot；
EDTA濃度為10mmol/L時，狗牙根葉片、根系SOD活性最低，顯著低于對照組，分別為116.80、99.94U/mg prot，這可能是由于高濃度EDTA與重金屬鉛形成的螯合物具有低毒性，降低了狗牙根的氧化應激反應。
由圖IB看出，不同濃度EDTA處理的狗牙根葉片POD活性均明顯高于根系。與對照相比，各濃度處理葉片POD活性無顯著差異：而2.5mmol/L低濃度EDTA處理顯著高于10mmol/L高濃度處理。不同濃度EDTA處理的狗牙根根系POD活性均顯著高于對照，且以10mmol/L處理最高，為194.33U/g，是對照的1.63倍，表明狗牙根根部受到脅迫時，啟動POD清除H207，降低鉛誘導的氧化應激，保護膜系統，增強狗牙根對鉛的耐受力。
由圖1C看出，隨EDTA濃度的增加狗牙根CAT活性整體呈現先下降后上升的趨勢，EDTA濃度為7.5mmol/L時，狗牙根葉片、根系CAT活性最低，分別為65.25、36.79U/mg prot．分別比對照顯著降低49.53%、49.99%，10mmol/L處理下CAT活性又顯著升高。不同濃度EDTA處理的狗牙根葉片CAT活性均明顯高于根系，可能是由于葉片是光合作用的主要器官，酶活性變化比較敏感。
由圖1D看出，重金屬鉛脅迫下狗牙根葉片與根MDA含量隨EDTA濃度的增加先升高后降低，且不同濃度處理均高于對照。2.5mmol/L EDTA處理的葉片MDA含量最高，為68.68 nmol/mg prot，顯著高出對照1.28倍，且明顯高于根部：EDTA濃度>2.5mmol/L時，各處理狗牙根葉片MDA含量均低于根部。5mmol/L EDTA處理下根部MDA含量最高，為56.07 nmol/mg prot，較對照顯著提高1.61倍；
其次為10mmol/L處理，是對照的1.95倍。
2.2不同濃度EDTA對重金屬鉛脅迫下狗牙根根際與非根際土壤磷形態的影響
施加不同濃度EDTA后狗牙根根際及非根際土壤中4種形態無機磷含量的變化如圖2所示。可以看出，根際與非根際土壤閉蓄態磷酸鹽（0-P）含量最高，磷酸鋁（A1-P）含量最低，且根際土壤各形態無機磷含量均高于非根際土壤。施加不同濃度EDTA后，狗牙根根際土壤0-P含量顯著低于對照，其中2.5mmol/L處理最低，為441.67mg/kg，較對照降低81.07%：在非根際土壤中，添加EDTA后（除5mmol/L）土壤O-P含量較對照有不同程度的增加，其中2.5mmol/L處理的最高，為600mg/kg，顯著高于對照。10mmol/L EDTA處理的狗牙根根際、非根際土壤磷酸鈣（Ca-P）含量較對照分別顯著降低39.42%、51.24%，但根際土壤中磷酸鐵（Fe-P）含量較高，為158.36mg/kg，顯著高于對照，是對照的1.92倍，說明添加EDTA有利于重金屬鉛脅迫下狗牙根根際土壤Fe-P含量的增加。
2.3不同濃度EDTA對狗牙根鉛含量、轉移系數及根際土壤鉛形態的影響
由表2看出，與對照相比，施加EDTA后狗牙根地上部、根部對鉛的富集明顯增加，并且隨ED-TA濃度的增加鉛富集量明顯升高。施加10mmol/L EDTA后狗牙根地上部和根部鉛含量分別達到19.36mg/kg和17.75mg/kg，分別為對照的8.84倍和1.91倍。EDTA的添加提高了狗牙根對鉛的轉移系數，且隨濃度的增加而升高，其中以10mmol/L處理的轉移系數最大，為1.19，是對照的4.96倍，這說明高濃度EDTA促進了重金屬鉛由根部向地上部的轉運。
不同濃度EDTA處理后狗牙根根際土壤中不同形態鉛含量的變化如圖3所示。可以看出，狗牙根根際土壤中鐵錳氧化態鉛含量最高，其次為殘渣態鉛、腐殖酸結合態鉛和強有機結合態鉛，有效態鉛含量最低。隨EDTA濃度的增加，狗牙根根際土壤有效態鉛含量也增加，并以10mmol/L處理的有效態鉛含量最高，為92.83mg/kg，與對照差異顯著，為對照的1.84倍；
根際土壤中鐵錳氧化態鉛含量隨EDTA濃度的增加顯著下降，且以7.5mmol/L處理最低，為183.88mg/kg；
10mmol/L處理的殘渣態鉛、腐殖酸結合態鉛、強有機結合態鉛含量分別為45.26、65.27、13.67mg/kg，均顯著低于對照。說明施用EDTA能夠有效促進土壤鐵錳氧化態鉛、殘渣態鉛、腐殖酸結合態鉛和強有機結合態鉛向有效態鉛轉化，增加了土壤中有效態鉛含量，進而提高土壤中可供植物吸收的重金屬鉛含量。
3討論
3.1重金屬Pb脅迫下施加EDTA對狗牙根抗氧化酶系統的影響
抗氧化酶系統及MDA在植物適應逆境過程中發揮重要作用。重金屬鉛脅迫下，狗牙根葉片SOD、POD、CAT活性及MDA含量總體上高于根系，可能是葉片是光合作用的主要器官，酶活性變化比較敏感。SOD在消除超氧化物自由基、減輕脂質過氧化作用和膜傷害方面發揮重要作用。在鉛污染土壤中施加不同濃度EDTA，狗牙根SOD活性先升高后下降，說明適宜濃度的EDTA對鉛脅迫下的狗牙根傷害起到緩解作用，使狗牙根適應脅迫環境的能力得到提高。一般認為，逆境脅迫下SOD活性會有所增加。也有研究表明SOD作為一種誘導酶，在重金屬鉛脅迫下植物體內02含量的增加能誘導其活性上升，SOD活性提高是02含量增加的應急解毒措施，是植物細胞免受毒害的調節反應。但高濃度EDTA處理下SOD活性下降，可能是由于EDTA與重金屬鉛螯合后，降低了細胞內的重金屬濃度或使其處于非活性狀態。POD廣泛存在于植物體各組織器官中，對過氧化物起清除作用，抑制其對膜脂的過氧化作用，避免膜損傷和破壞。本研究中，施加EDTA對狗牙根葉片POD活性影響不明顯，而顯著提高根部POD活性，且以10mmol/L處理最高，為194.33U/g。表明根部受到鉛與EDTA脅迫后優先啟動POD清除H，02，這與Habiba等的研究結論類似。過氧化氫酶（CAT）是一種包含血紅素的四聚體酶，可與SOD協同消除H202，保護細胞膜結構。EDTA濃度為7.5mmol/L時，狗牙根葉片、根系CAT活性最低，分別為65.25、36.79U/mg prot。植物細胞壁是重金屬離子進入細胞的第一道屏障，狗牙根作為耐性植物，其耐重金屬的原因可能是細胞壁對重金屬有沉淀作用，因而降低了重金屬進入細胞的濃度，進而減輕對根細胞結構、葉片及其生理功能的傷害。10mmol/L EDTA處理的CAT活性升高，表明施加高濃度EDTA提高了狗牙根的氧化應激。MDA是植物細胞膜脂過氧化作用的最終產物，對細胞膜具有毒害作用。本研究中，隨ED-TA濃度的增加MDA含量呈現先上升后下降趨勢，高濃度EDTA處理下MDA含量降低，這是因為EDTA與重金屬鉛螯合形成螯合物，膜脂過氧化程度減輕。一般認為，MDA在植物體內增加的原因有兩點：一是與自由基有關，02傷害植物的機理之一在于參與啟動膜脂過氧化或膜脂脫脂作用．在H202作用下，通過Habe-weiss生化反應產生攻擊力更強的羥基，并啟動膜脂過氧化，造成MDA含量增加：二是與活性氧有關，活性氧對許多生物功能分子有破壞作用，如氨基酸、蛋白質、糖類等，最終引起膜脂過氧化作用，導致MDA含量增加。
3.2重金屬Pb脅迫下施加EDTA對土壤無機磷的影響
EDTA具有較強螯合作用，施人土壤后對磷素有解吸作用，可降低土壤膠體對磷的固定，同時與磷爭奪鈣、鎂、鐵、鋁等陽離子和土壤吸附位點，促進難溶性磷的釋放與轉化從而增加其有效態含量。王曉純研究指出未起到增加效果的處理可能是土壤中易轉化態的養分含量過低，導致EDTA對養分的螯合作用較弱。EDTA施入后促使根際微生物分泌更多的有機酸、磷酸酶及質子等，促進難溶性磷的活化，提高作物的磷素吸收。許多研究表明，向土壤中施入腐殖酸和EDTA可提升土壤磷素的有效性。本試驗中，施加EDTA后狗牙根根際、非根際土壤中O-P含量均高于其它形態磷，且根際土壤各形態無機磷含量總體高于非根際土壤。10mmol/L EDTA處理后狗牙根根際、非根際土壤Ca-P含量均最低，而根際土壤中Fe-P較高。這可能是由于EDTA通過螯合作用與磷酸根競爭土壤中的吸附位點以降低磷的吸附，促進磷素釋放，同時促進根際土壤Fe-P、O-P等無機磷的活化，進而利于狗牙根對磷的吸收。有研究發現，添加EDTA和低分子量有機酸會增加土壤中的無機磷，這主要來自Ca-P、Al-P、Fe-P等的累積，而對O-P含量影響不大。本研究結果與前人的結論相似，添加螯合劑EDTA總體上增加了根際土壤的無機磷總量，并改變土壤各形態無機磷占無機磷總量的比例。
3.3重金屬Pb脅迫下施加EDTA對狗牙根鉛含量、轉移系數及根際土壤鉛形態的影響
施加EDTA后土壤重金屬主要以螯合物的形式存在，而在金屬螯合物作用下植物根部內皮層的凱氏帶易被破壞，原因可能是EDTA具有破壞細胞膜通透性的能力，導致金屬螯合物進入根部組織。因此，EDTA的施加可以增加重金屬從根到地上部的轉移。本試驗中EDTA的施加促進了狗牙根根部對重金屬鉛的吸收及地上部對鉛的積累，且隨EDTA濃度的增加而升高。螯合劑通過與土壤重金屬螯合，提高重金屬在土壤溶液中的溶解度，但螯合后的重金屬能否被植物吸收一直是個有爭議的問題。有研究認為植物的根不能吸收螯合劑及其金屬螯合物。而Vassil等通過水培試驗發現，鉛和EDTA處理的印度芥菜，其地上部能同時積累EDTA和鉛，且以Pb-EDTA的形式向上運輸，植物體內EDTA與鉛的比例為1：0.67，該研究認為Pb-EDTA能夠被植物所吸收。本研究中，隨EDTA濃度升高，狗牙根地上部和根系對重金屬鉛的吸收增加。當EDTA施加濃度為10mmol/L時，狗牙根鉛含量最高，轉移系數最大，為1.19，說明高濃度EDTA促進重金屬鉛由地下部向地上部轉運。
土壤重金屬鉛以鐵猛氧化態為主，而這種形態鉛較難被植物吸收利用。螯合劑EDTA能活化土壤中的鉛，使其更易被植物吸收或吸附去除，從而降低土壤鉛含量。本試驗中，有效態鉛含量隨EDTA濃度的增加總體呈升高趨勢，而鐵錳氧化態鉛呈現下降趨勢。強有機結合態鉛在有機質分解時被逐漸釋放，因此狗牙根對土壤重金屬鉛的吸收與其形態分布密切相關。當EDTA濃度為10mmol/L時，根際土壤有效態鉛含量高于其它形態鉛含量（除鐵錳氧化態外），說明施用EDTA能夠有效促進鉛形態的轉化，增加植物對鉛的吸收利用，這可能是由于施人EDTA后導致土壤溶液中的自由離子減少，打破沉淀溶解平衡，促進其它形態鉛向有效態轉變，從而形成新的沉淀溶解平衡：也有研究認為EDTA與Pb形成的螯合物亦屬于有效態，其原因在于EDTA本身帶有6個電子基團，分布在氮原子及羧基上，可以與土壤中重金屬離子反應，通過釋放土壤顆粒上吸附的重金屬離子進而增加土壤中有效態重金屬含量。綜上所述，狗牙根修復鉛污染土壤過程中，EDTA的施用濃度以10mmol/L為宜，促進狗牙根根際土壤鉛形態轉化的效果較好。
4結論
重金屬鉛脅迫下施加EDTA可提高狗牙根的氧化應激反應，增強狗牙根在高濃度鉛脅迫下的耐受能力。10mmol/L EDTA處理顯著降低重金屬鉛脅迫下狗牙根根際與非根際土壤難溶Ca-P含量，提高根際土壤Fe-P含量：促進根際土壤中鐵錳氧化態鉛、腐殖酸結合態鉛、殘渣態鉛、強有機結合態鉛向有效態鉛的轉化，提高狗牙根地上部、根部對鉛的富集吸收。因此EDTA作為修復重金屬鉛污染土壤的有效螯合劑．可明顯提高狗牙根對鉛污染土壤的修復作用。
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