劉立明,湯 芳,劉 斌,付婷婷,4,范君文,白新鴿,趙翠青,白杰英,7*
(1.吉林農業科技學院 動物科技學院,吉林 吉林市 132101;2.武警特色醫學中心研究部 突發公共衛生事件醫學防治研究所,北京 102613;3.吉林省金泰美迪生物技術有限公司,吉林 長春 130122;4.中國科學院 理化技術研究所 抗菌材料檢測中心,北京 100190;5.北京市動物疾病預防控制中心,北京 100020;6.青島科技大學 高分子科學與工程學院,山東 青島 266042;7.北京大學 國家生物醫學成像科學中心,北京 100871)
野生鼠類是生態系統中重要的一員,也是易于被蜱寄生的動物宿主,其在城市、森林、草原、荒漠等多種生境中均有分布,本身可通過直接或間接途徑傳播鼠疫、腎綜合征出血熱、鉤端螺旋體病等多種自然疫源性疾病[1],亦可攜帶包括巴貝西蟲、螺旋體、斑點熱群立克次體、無形體在內的多種蜱媒病原體。有研究報道在黑線姬鼠和東方田鼠中發現巴貝西蟲[2];靳木子等[3]和烏蘭圖雅等[4]在毛足鼠、長爪沙鼠、黑線倉鼠、長耳跳鼠、五趾跳鼠和達烏爾黃鼠中均發現伯氏疏螺旋體;ZHAN等[5]和CAO等[6]在黑線姬鼠、日本田鼠、長尾姬鼠等多種鼠類中發現立克次體和無形體。鼠作為蜱的寄生宿主,之所以能夠成為蜱媒疾病病原體的儲存宿主,主要取決于其生態與生理學特征[7],如宿主分布特點、種群優勢、數量相對穩定以及對病原體的高感受性、低敏感性,帶病毒率相對穩定,并能通過多種途徑排出病原體等因素;其次,其種群數量、帶病毒率的季節和年度波動與人類疫情流行強度基本吻合[8],大大提高了蜱傳疾病的感染風險。
近年來,一些新發現的蜱媒疾病,如人巴貝西蟲病、萊姆病、斑點熱、無形體病等在我國及周邊國家和地區不斷涌現,且發病區域和發病率不斷擴大和上升,對人類的健康和國民經濟建設造成很大危害,已受到世界各國的普遍關注和重視[9]。北京地區作為我國首都和重要的旅游城市,地形地貌復雜,生態環境類型多樣,動植物區系豐富,人口流動復雜,為媒介蜱和宿主動物的繁衍生息以及為蜱傳疾病的發生和持續存在提供了必要條件。最近,我國學者又在蜱中陸續發現多種新發蜱傳病原體,如**地區的馬賽立克次體(R.massiliae),暫定巴布瑞立克次體(C.R.barbariae)[10];北京地區的一種新無形體——北京無形體[11]。隨著全球氣候變暖,自然災害的發生,氣候和生態環境的不斷改變,大規模國防和經濟建設,畜牧業和旅游業的快速發展以及貿易的不斷流通,全球一體化進程的加快導致蜱和宿主動物的種類、密度、分布和生活環境可能發生變化[12]。人類進入蜱媒疾病疫源地和接觸野外蜱和宿主動物的機會大大增加,打破了病原體-媒介-宿主的固態平衡,致使原有地區的蜱媒疾病的發生范圍會擴大、發生頻率和強度會增加,一些新的蜱媒疾病也會不斷出現,更加劇了蜱媒傳染病的暴發和流行,使得蜱媒傳染病不斷發生,給人類健康和社會經濟造成影響,其預防控制變得更加復雜。舊發蜱傳病原體的暴發和新發蜱傳病原體的不斷出現,給科研人員和防疫人員帶來了巨大挑戰。
本研究共選取北京市十渡、云蒙山和東靈山3個地區為采樣點,于2018-2019年間對該地區采集的鼠類動物樣本進行多種病原體分子生物學檢測,并選取有代表性陽性樣本進行測序和核苷酸序列分析,基于目的基因序列構建系統發育樹,確定病原體的分類學位置。為進一步研究北京地區宿主動物和媒介蜱中蜱媒病原體的種類和分布提供理論依據。
1.1 鼠樣本的采集根據本研究需要,于2018-2019年間在北京市部分景點中采集鼠種開展流行病學調查,包括北京市門頭溝區東靈山、密云區云蒙山、房山區十渡共3個調查點采集鼠種。采用夾夜法和誘捕法捕獲鼠,并現場鑒定種類。經消毒處理后,解剖取其脾臟,-20℃短期保存備用,長期保存于-80℃。
1.2 主要試劑與儀器AllPrep DNA/RNA Mini Kit DNA/RNA提取試劑盒購自Qiagen公司;DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)購自Thermo Fisher Scientific公司;DL2000 DNA Marker和去離子水購自TaKaRa公司;溴化乙錠(EB)和無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司;本研究所用PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。臺式高速離心機購自Eppendorf公司;VeritiTM96-Well Thermal Cycler購自Applied Biosystems公司;DYY-8C穩壓穩流電泳儀購自北京六一儀器廠;Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統購自Bio-Rad公司;海爾MZC-2070M1微波爐購自海爾公司;HH-S-4恒溫水浴箱購自Amersham公司;Tissuelyser-24L組織研磨儀購自上海凈信科技;A2型生物安全柜購自美國Thermo公司。
1.3 試驗方法
1.3.1樣本處理及核酸提取 無菌條件下剖解小鼠,采取鼠脾臟標本,從鼠脾臟標本中提取脾臟及感染病原體總的基因組,將鼠的脾組織剪碎至20～30 mg的碎塊放入2 mL的EP管中,加入潔凈鋼珠2～3顆、500～800 μL無菌PBS,使用組織研磨儀研磨至勻漿,使用AllPrep DNA/RNA Mini試劑盒提取核酸。
1.3.2蜱媒病原體基因PCR擴增檢測 分別以巴貝西蟲18S rRNA、伯氏疏螺旋體16S rRNA、斑點熱群立克次體ompA、無形體16S rRNA特異性引物(表1),采用巢式PCR方法擴增目的片段,反應體系25 μL:DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,Nuclease-free water 9.5 μL,DNA模板2 μL。反應條件見表2,進行2輪PCR反應。PCR反應完成后,取第2輪擴增產物4 μL進行瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像儀觀察并記錄結果。
表1 蜱媒病原體檢測所用引物序列及相關信息
表2 蜱媒病原體檢測PCR反應條件
1.3.3PCR產物測序及核苷酸序列分析 將PCR擴增的陽性樣本送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化并完成序列測定。將測出陽性標本的基因序列使用DNAstar軟件拼接后登陸到NCBI,將拼接后的序列與GenBank中注冊的核苷酸序列進行BLAST最大同源性比對分析,確認是否為感染蜱媒病原微生物的目的基因,并用MEGA 7.0軟件做系統發育樹分析,采用基于maximum composite-likelihood模型的Neighbor-Joining法構建遺傳進化樹。通過1 000次重復算法獲取穩定的遺傳進化樹,確定其分類學位置。
1.4 統計學分析采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析,采用Fisher確切概率法來比較不同地區和鼠種的蜱媒病原體的感染率。P<0.05,差異具有統計學意義。
2.1 宿主動物與媒介調查結果分析
表3 北京部分地區野鼠的種類及分布 只
表4 北京地區不同種類鼠中感染情況 只
北京地區的3個調查點感染情況見表5,發現東靈山存在巴貝西蟲、伯氏疏螺旋體和無形體感染,感染率分別為10.40%(31/298)、2.01%(6/298)和6.47%(18/298);云蒙山地區存在巴貝西蟲、伯氏疏螺旋體、斑點熱群立克次體和無形體感染,感染率分別為21.11%(19/90),4.44%(4/90),1.11%(1/90)和10.00%(9/90);十渡存在巴貝西蟲和無形體感染,感染率分別為12.22%(11/90)和5.56%(5/90)。各調查點間比較,3個調查點在巴貝西蟲檢測中存在統計學意義(P=0.035)。
表5 北京地區不同調查點感染情況 只
表6 不同鼠種復合感染檢測情況 只
2.2 部分病原體核苷酸序列的測定與分析
圖1 巴貝西蟲18S rRNA基因同源性分析
圖2 伯氏疏螺旋體16S rRNA基因同源性分析
圖4 無形體16S rRNA基因同源性分析
——勞氏立克次體的研究現狀中國人獸共患病學報(2015年4期)2015-01-251949—1966年北京地區貞操觀的變革——解放與進步社會生活探索(2014年0期)2014-10-17北京地區地下水人工回灌簡介城市地質(2013年1期)2013-03-11