? 唐銘鑫 符天昊 楊韜壇 沈子豪 龔海健 歐躍紅 劉葉蔓 寧露云
摘要：該研究分別以葉片、根狀莖、芽以及種子為外植體，基于前人研究對培養基配方進行優化，共確定了21種培養基配方，從中篩選適用于湖南多花黃精的最佳萌發培養基、最佳增殖培養基以及最佳生根培養基配方，建立了湖南多花黃精快速繁殖體系。結果表明：以當年采收的種子為外植體，消毒后縱切再接種培養效果較好；
最佳萌發培養基配方為：B5+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂+2.0 mg/L GA3；
最佳增殖培養基配方為：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂；
最佳生根培養基配方為：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。該研究為湖南多花黃精組培苗的生產奠定了堅實的理論基礎，為進一步擴大多花黃精的人工種植規模提供了技術支撐。
關鍵詞：多花黃精；
組織培養；
萌發；
增殖；
生根
中圖分類號：S567.239文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2024）05-0007-06
A Rapid Propagation System for Polygonatum cyrtonema in Hunan
TANG Ming-xin1，FU Tian-hao1，YANG Tao-tan1，SHEN Zi-hao1，GONG Hai-jian1，OU Yue-hong2，
LIU Ye-man1，NING Lu-yun1
（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， PRC; 2. Loudi Zhifang Biotechnology Co.， Ltd.， Loudi 417000， PRC）
Abstract：
This study aimed to establish a rapid propagation system for Polygonatum cyrtonema in Hunan. With the leaves， rhizomes， buds， and seeds as explants， 21 media were designed based on the available studies， and the optimal media for germination， propagation， and rooting of P. cyrtonema were selected. The results indicated the fresh seeds harvested in the current year were the best explants， and those disinfected and cut longitudinally showcased good performance in tissue culture. The optimal medium for germination was B5 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT + 30 g/L sucrose + 6.0 g/L agar + 2.0 mg/L GA3. The optimal medium for propagation was MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 30 g/L sucrose + 6.5 g/L agar. The optimal medium for rooting was 1/2 MS +
1.0 mg/L NAA + 30 g/L sucrose + 6.5 g/L agar. The findings lay a theoretical foundation for producing tissue culture seedlings and provide technical support for expanding the planting scale of P. cyrtonema in Hunan.
Key words：
Polygonatum cyrtonema; tissue culture; germination; propagation; rooting
中藥黃精味甘性平，具有養陰潤肺、補氣健脾的功效，主治心悸氣短、肺燥干咳、久病津虧口干、體虛乏力以及糖尿病、高血壓等癥，屬于常用的藥食同源植物[1]。據《中華人民共和國藥典》記載，中藥黃精為百合科（Liliaceae Juss）黃精屬（Polygonatum Mill）植物黃精（Polygonatum sibiricum Red.）、滇黃精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖[2]。其中，黃精在內蒙古武川、卓資、涼城和河北遵化、興隆、承德等地區分布較多；
滇黃精主要分布于云南、四川及貴州等地；
多花黃精則主要集中在湖南、安徽、湖北、浙江等南方地區[3]。湖南省內分布的黃精資源十分豐富，有多花黃精、卷葉黃精、輪葉黃精、滇黃精、二苞黃精、長梗黃精、湖北黃精和垂葉黃精等，其中分布最廣的為多花黃精，品質上乘且蘊藏量大，是我國多花黃精的主要產地之一[4]。隨著對多花黃精的開發利用，其野生資源遠遠不能滿足市場需求，發展人工栽培技術、擴大多花黃精的人工種植規模具有重要的現實意義。
多花黃精結實量大，但種子存在形態休眠和生理休眠現象[5-6]，成苗率低，育苗周期長（播種后2 a才能長出真葉）[7]，在一定程度上限制了多花黃精的栽培和應用。在多花黃精常規栽種中，通常以根狀莖進行繁殖，一般選用長勢好且具有健康芽頭的根狀莖做種[8]，也可以選擇1～2年生且健壯、無病害的根狀莖先端的幼嫩部分栽種[9]。但由于移栽時期、種苗標準不一，成活率不高，需要大量補苗，并且成活后的植株生長不一致，嚴重制約了多花黃精的標準化生產。此外，雖然根狀莖繁殖取材方便、操作簡便，但是需要耗費大量的藥用部位，成本較高，并且長期利用無性繁殖容易造成感染病害、品種退化等問題。
隨著植物生物技術的快速發展，科研工作者對多花黃精的高效再生體系進行了積極探索，目前已取得了一些進展：王輝等[10]以多花黃精種子萌發后的幼芽為啟動材料進行組織培養，選出了最佳愈傷組織誘導、不定芽增殖及生根培養方案；
莫勇生等[11]以多花黃精無菌種子為外植體，選出了多花黃精組培過程中啟動培養、繼代培養及生根壯苗的最佳培養基配方；
陳松樹等[12]則建立了以葉片為起始材料的多花黃精再生體系，在MS培養基的基礎上添加不同濃度的2，4-D、NAA和6-BA，成功篩選出誘導愈傷組織、叢生芽以及生根的最佳培養基配方；
吳宇函等[13]以未成熟的多花黃精果實為外植體，成功建立了植株組培快繁體系；
劉芳源等[14]以多花黃精根狀莖為外植體篩選出芽增殖系數較高的配方。此外，還有一些以種子、根狀莖為外植體的多花黃精組培體系的報道[15-18]。但是，不同地區的多花黃精種質資源遺傳背景存在差異，故其組織培養體系可能不能通用。
湖南省為多花黃精的主要產地之一，栽培規模大，亟需大量種苗，導致目前多花黃精種苗價格居高不下。該研究分別以葉片、根狀莖、芽以及種子為外植體，基于前人研究對培養基配方進行優化，篩選適用于湖南多花黃精的最佳萌發培養基、最佳增殖培養基以及最佳生根培養基配方，建立湖南多花黃精快速繁殖體系，旨在為多花黃精組培苗的工廠化生產以及穩定供應奠定堅實的理論基礎，為擴大多花黃精的人工栽培提供技術支撐。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
研究所用多花黃精外植體材料均來自湖南省懷化市雪峰山林場，于2022年9月收集成熟的多花黃精果實，人工去除果皮、清洗晾干后將種子保存于4 ℃冰箱備用，視為當年采收種子。同時，冰箱里保存有2021年采收的種子，視為往年種子。
1.2 試驗方法
1.2.1 外植體處理 首先將外植體（葉片、根狀莖、芽和種子）用清水洗凈，并放到流水下沖洗過夜，之后在超凈工作臺中操作：75%酒精潤洗45 s，0.1%升汞消毒7 min，無菌水沖洗5遍，置于無菌濾紙上吸干備用。將消毒后的葉片切成0.8 cm×0.8 cm的小塊；
將根狀莖切成長0.8 cm、寬0.8 cm、厚0.3 cm的小塊；
將帶芽根狀莖切去多余部分，保留芽頭；
將種子直接接種到培養基中，或沿種孔和種臍的方向縱切，保留含有白色胚的部分（圖1）；
將上述處理后的外植體放到對應的培養基中。
1.2.2 培養基配方 該研究共確定了21種培養基配方，其中萌發培養基配方見表1，增殖和生根培養基配方見表2。MS、1/2 MS以及B5培養基購自青島海博生物技術有限公司，所有激素均購自Sigma公司，蔗糖、瓊脂和肌醇購自上海麥克林生化科技股份有限公司。
1.2.3 培養方法 配方1～6：以葉片和根狀莖為外植體分別培養3批，每批12個皿，每個皿接種12～15塊外植體；
配方7：以基地采的地下根狀莖芽為外植體培養3批，每批12瓶，每瓶接種2～3個芽；
配方8～11：以完整種子和縱切種子作為外植體分別培養3批，每批12個皿，每個皿接種6～12顆種子；
配方12～15：將種子縱切后接種，分別培養3批，每批12個皿，每個皿接種6～12顆種子；
配方16～18：以無菌種子萌發的初生根狀莖為外植體，每個配方培養3批，每批15瓶，每瓶接種1～3個芽；
配方19～21：將增殖培養得到的叢生芽按單個生長點切下（同時帶有部分根狀莖組織），垂直插入培養基中，每個配方接種3批，每批15瓶，每瓶2～3棵。
1.2.4 滅菌與培養條件 所有培養器皿、接種工具以及不同配方的培養基均在121 ℃、0.125 MPa條件下滅菌25 min后使用（其中GA3為抽濾滅菌）；
所有培養基pH調至5.8～6.0；
組培室培養條件設置為：光照強度2 000 lx、溫度25 ℃、濕度80%、白天和黑夜各12 h。
1.3 數據處理
采用SPSS 22軟件對數據進行處理與統計學分析。
2 結果與分析
2.1 萌發培養基配方的篩選
2.1.1 以葉片、根狀莖和芽為外植體的培養情況 在配方1～6號培養基中，葉片及根狀莖都在培養30 d內褐化死亡；
在配方7號培養基中，根狀莖芽陸續污染死亡（可能是使用的地下根狀莖芽攜帶大量土壤微生物，外植體消毒難度較高導致消毒不徹底），而未出現污染的材料直至60 d后也無任何生長跡象，芽頭一直處于休眠狀態。可見，配方1～7號培養基不適用于湖南多花黃精的培養。
2.1.2 以種子為外植體的培養情況 在配方8號培養基中，完整種子和縱切種子在培養40 d后均未萌發；
在配方9～11號培養基中，完整種子培養40 d后未萌發，但縱切種子培養20 d即生出初生根狀莖和芽，開始萌發，以多花黃精種子為外植體的組織培養過程見圖2。培養40 d后對縱切種子萌發率進行統計（圖3），結果表明，配方9～11號培養基中的萌發率都比較低。為了提高萌發率，該研究在配方11的基礎上進行了改良，得到了配方12～15。同樣將種子縱切后接種，培養至40 d統計萌發率。如圖3所示，在添加GA3后，多花黃精種子萌發率有了顯著提高，尤其是配方14和配方15。以上結果均來自當年采收的新鮮種子。同時，該研究對保存在冰箱的往年種子進行了相同的萌發試驗，發現往年種子內生菌較多，污染嚴重，無法進行后續試驗。由此可知，往年種子不適合作為外植體進行多花黃精的快速繁殖，應以當年采收的新鮮種子為宜。
2.2 增殖培養基配方的篩選
為了篩選適合湖南多花黃精芽增殖的培養基配方，該研究在前人研究結果（配方16）的基礎上另外設計了配方17和18，并以由種子萌發后分化的帶芽初生根狀莖為材料進行增殖培養。培養結果發現，在18號培養基中，10 d后便可看到初生根狀莖明顯膨大，并伴隨多個芽生長點的分化，之后陸續長出葉片。根據圖4可知，與另外2個配方相比，配方18的芽長勢最旺，葉片肥厚濃綠。最后對培養40 d的材料進行芽增殖倍數的統計（圖5），發現配方18的芽增殖倍數最高，可達19.48倍，顯著高于配方16和配方17。這些結果說明配方18比較適合湖南多花黃精芽的增殖培養。
2.3 生根培養基配方的篩選
生根培養是生產組培苗的一個重要過程。1/2 MS培養基是植物組織培養中常用的生根培養基，與MS培養基相比，1/2 MS培養基中大量元素減半，更有利于生根。該研究在1/2 MS培養基的基礎上添加不同濃度的NAA，設計了配方19～21，探討多花黃精芽的生根情況。培養10 d后，配方21中出現根的分化，其他配方在15～20 d后才陸續出現根的分化。30 d后觀察3個配方中芽的生根情況，根據圖6可知，配方21中的根系明顯比另外2個配方發達，更有利于后續的煉苗移栽。對3個配方中芽的生根率進行統計，根據圖7可知，配方21的生根率高達90.62%，顯著高于配方19和20。
3 討論與結論
湖南省內分布的黃精資源豐富，其中多花黃精分布最廣、品質上乘且蘊藏量大[4]。近年來，人們對多花黃精的需求持續增高，湖南各地區開始大量種植多花黃精，如婁底新化、懷化洪江、益陽安化等地。大規模的種植需要大量的種苗，而多花黃精種子存在休眠機制，因而繁殖難度較大，且長期利用根狀莖繁殖易造成品種退化[19]，這些不利因素極大地制約了湖南多花黃精種植規模的擴大。植物組織培養技術具有繁殖速度快、脫毒、占用空間小等優勢，目前已經成功應用到多種植物的種苗生產
中[20-22]。目前，植物組織培養技術也已經開始應用到多花黃精的種苗研究中[10-18]，但是鮮有關于湖南多花黃精組織培養體系的報道。因此，該研究在前人的研究基礎上對不同階段的培養基配方進行了優化，以期建立適用于湖南多花黃精的快速繁殖體系。
首先，該研究發現配方1～8均不能誘導愈傷組織與芽的萌發，其中葉片和根狀莖最終都褐化死亡，而芽和種子均不能解除休眠。配方1～8所參考的研究中的試驗材料均來自不同地區，可見由于材料的遺傳背景不同，使用同一配方進行培養，結果也會存在差異。此外，參考鐘燦等[15]的配方9～11進行培養時，發現種子萌發率較低。GA3常用于解除種子休眠[23]，因此，該研究基于配方11進行改良，在配方中添加了不同濃度的GA3，結果配方14和15中種子萌發率顯著高于其它配方。但是，目前配方中最高的萌發率還不到20%，故后續還需要進一步優化配方，提高種子萌發率。
在增殖培養中，3個配方都能促進初生根狀莖中芽的增殖并形成愈傷組織，但配方18的增殖倍數顯著高于其他2個配方。可見，2，4-D和NAA雖然都是生長素類的植物激素，但是在湖南多花黃精芽的增殖過程中NAA效果更好。在生根培養中，設計了3個配方，其中配方19的生根率明顯低于配方20和21，且長出的根系稀疏；
而配方21中多花黃精根系發達且生根率高達90.62%。而根據王輝等[10]的研究：1/2 MS+0.1 mg/L NAA為最適宜的生根培養基配方，這個配方中NAA的濃度低于筆者研究設計配方的NAA濃度，出現這種差異的原因可能是試驗材料的產區不同，說明湖南多花黃精的生根誘導需要較高濃度的NAA。
綜上所述，基于前人研究經驗，該研究對培養基配方進行了優化，最終成功建立了湖南多花黃精快速繁殖體系：以當年采收的種子為外植體，消毒后進行縱切再接種培養；
最佳萌發培養基配方為：B5+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂+2.0 mg/L GA3；
最佳增殖培養基配方為：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂；
最佳生根培養基配方為：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。該研究為湖南多花黃精組培苗的生產奠定了堅實的理論基礎，為進一步擴大湖南多花黃精的人工種植規模提供了技術支撐。
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（責任編輯：王婷）
收稿日期：2023-12-18
基金項目：湖南省自然科學基金項目（2023JJ40482）；
湖南中醫藥大學2022年度校級大學生創新訓練項目；
湖南省教育廳科學研究項目（22C0189）；
2023年湖南省重點研發計劃（2023SK2046）；
2022年度中醫藥民族醫藥國際聯合實驗室開放基金（2022GJSYS09）；
湖南中醫藥大學校級科研項目（2021XJJJ015）
作者簡介：唐銘鑫（2002—），男，湖南衡陽市人，本科生，研究方向為植物生物技術。
通信作者：劉葉蔓，寧露云
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