［摘 要］PCR技術是基因工程中獲取和擴增目的基因的常用方法之一，其中常考查到的知識點有與引物相關的問題、酶切片段分析及變性、復性、延伸等環節的相關分析等。文章結合典型考題對這幾個問題進行歸納分析。
［關鍵詞］基因工程；
PCR技術；
常考知識點
［中圖分類號］??? G633.91??????? ［文獻標識碼］??? A??????? ［文章編號］??? 1674-6058（2024）14-0080-04
【名師簡介】曾凡洪，中學高級教師，武漢市學科帶頭人，曾擔任高中生物奧賽主教練。先后在《生物學教學》《中學生物教學》《中學教學參考》《高中生學習》等報紙雜志上發表文章50余篇，并參與多本著作的編寫。
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，其最大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大后進行比對，這也是“微量證據”的威力之所在。PCR的理論依據是DNA復制，一般的中學實驗室很難具備相應的實驗設備和操作條件，因此對于這塊知識，基本上是以理論講解為主。目前的一些考題涉及的PCR知識已經比較具體和深入了，具有一定的難度。本文結合典型考題對基因工程中PCR技術常考知識點進行歸納分析。
一、與引物相關的問題
引物是一小段單鏈DNA或RNA，是DNA復制的起始點。在引物的3＇—OH上，核苷酸以酯鍵形式進行加成，因此引物的3＇—OH必須是游離的。引物分為兩種：存在于自然生物的DNA復制引物（RNA引物）和PCR中人工合成的引物（通常為DNA引物）。一般所說的引物是指DNA引物。PCR中的引物是人工合成的兩段寡脫氧核苷酸序列。
（一）設計引物的基本要求
根據DNA復制原理和引物的作用，在設計引物時，要注意以下幾個基本問題。
1. 引物自身不應存在互補序列
若引物自身存在互補序列，引物自身就會折疊成發卡結構，這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。一般要求引物自身不能有連續4個堿基的互補。
2.引物與引物之間不應存在互補序列
兩個引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3＇端的互補重疊，以防止引物二聚體的形成。一般要求引物之間不能有連續4個堿基的互補。
3.引物中G+C堿基應占一定的比例
G+C堿基含量盡量控制在40%到60%之間，解鏈溫度（Tm值）最好貼近72 ℃，G+C堿基含量太低會導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于增強PCR的特異性；
G+C堿基含量太高也易于引發非特異擴增。
4. 一對引物中G+C堿基占比最好基本相等
一對引物中G+C堿基占比基本相等可防止引物對在退火、延伸等環節反應差別太大。
（二）帶有一個引物和帶有一對引物的比例問題（放射性DNA含量的比例分析）
在設計引物時，若用放射性同位素標記，則產物中也會出現放射性，分為一條鏈帶有放射性和兩條鏈帶有放射性兩種情況，對應的是產物帶有一個引物和帶有一對引物。
（三）兩條鏈等長的DNA分子最先出現在第幾輪循環及所占的比例問題
引物結合到模板鏈上時，一般會從模板鏈的3＇端靠近內側段結合上去，導致剛擴增產生的DNA分子兩條鏈不等長。隨著擴增輪數的增加，會逐漸出現兩條鏈等長的DNA分子，且其比例會逐漸增加。
【典例1】（2011·江蘇，第33題節選）請回答基因工程方面的有關問題：
（1）利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似（如圖1所示）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。
①從理論上推測，第四輪循環產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為???????????????????? 。
②在第????????????? 輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。
圖1
解析：PCR擴增（或DNA復制）時，一對引物分別結合到兩條模板鏈上，根據半保留復制的特點，只有1個DNA分子不含有引物A（含引物B），經過四輪循環，產生24（16）個DNA分子，含有引物A的DNA片段有15個。
DNA分子復制時，每次只有用上一輪新形成的DNA單鏈為模板，所合成的DNA分子的長度才會逐漸縮短，直到出現兩條鏈等長的DNA分子為止。因此，可以用圖2來表示DNA復制的輪數與DNA分子長度之間的關系：從上往下，上面的一條鏈是模板鏈，下面的一條鏈是新合成的子鏈，下一輪復制時始終是以下面這條鏈為模板所形成的DNA分子才是最短的，則經過第三輪復制后，出現了兩條鏈等長的DNA分子。且以一條鏈為模板時，到第三輪就會出現1個兩條鏈等長的DNA分子，因此，一個DNA分子經過第三輪循環后就會出現2個兩條鏈等長的DNA分子，所占的比例為2/23=1/4。
圖2
答案：15/16??? 三
（四）需要的引物數與循環次數之間的關系
PCR擴增過程中，循環了n次，則得到的DNA分子數為2n，脫氧核苷酸鏈數為2×2n，其中只有2條模板鏈不帶有引物，則循環n次時，所需要的引物數為2×2n-2。
（五）引物末端修飾問題
在基因工程中，有時為方便構建重組質粒，在引物中需要增加恰當的限制酶切點，或為了顯示目的基因所在位置、產生定向變異等，需要對引物進行適當的修飾。引物的5＇端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴增的特異性；
而引物的延伸是從3＇端開始的，該端不能進行任何修飾。引物的5＇端修飾包括加酶切位點、加標記熒光、引入蛋白質結合DNA序列、引入點突變、插入突變、缺失突變序列、引入啟動子序列等。
【典例2】（2021·山東，第25題節選）人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有 BCL11A 蛋白結合位點，該位點結合 BCL11A 蛋白后， γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定 BCL11A 蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖3所示。
圖3
（1）為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖3可知，在 F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是?????????????? ，在 R 末端添加的序列所對應的限制酶是?????????????? 。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要?????????????? 種酶。
解析：此題具有一定的難度，首先應讀懂題意。要在熒光蛋白基因前面插入γ基因上游不同長度的片段，并能使熒光蛋白表達，只能分別用MunⅠ和XhoⅠ來對熒光蛋白基因的前面部位進行切割，且根據F1～F7片段表達的方向（左→右）和熒光蛋白基因表達的方向（右→左），只能F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶與XhoⅠ產生的黏性末端相同，R末端添加的序列所對應的限制酶與MunⅠ產生的黏性末端相同，再根據圖3中提供的五種限制酶識別序列及切割位點可知，與XhoⅠ產生相同的黏性末端的限制酶只能是[SalⅠ，]與MunⅠ產生相同的黏性末端的限制酶只能是EcoRⅠ。從產物擴增到載體構建完成的整個過程需要Taq DNA聚合酶、限制酶[SalⅠ、][EcoRⅠ、][XhoⅠ、][MunⅠ、]DNA連接酶共6種酶參與。
答案：SalⅠ EcoRⅠ 6
（六）引物結合位置的確定問題
為了獲得符合要求的PCR產物，不僅要求引物設計合理，還應考慮引物與模板鏈的結合部位的恰當性。
【典例3】（2020·江蘇，第33題節選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如圖4（以EcoRⅠ酶切為例）：
圖4
請據圖回答問題：
（3）若如表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是????????????????????????? （從引物①②③④中選擇，填編號）。
[????? DNA序列（虛線處省略了部分核苷酸序列）? 已知
序列?????? [5＇-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3＇][3＇-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5＇]???? PCR
引物?????? ①5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇
②5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇
③5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇
④5＇-TCATGAGCGCATAGTT-3＇??? ]
解析：此題難度較大，根據堿基互補配對原則，引物①②③④結合到已知序列上的位置及延伸方向如下表所示（“→”方向表示延伸方向）：
[????? DNA序列（虛線處省略了部分核苷酸序列）? 已知
序列?????? ????????????????????????????????????? ←④??????? ????????????????????????????????????←③
[5＇-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3＇][3＇-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5＇
]
①→???????????????????????????????????????????? ②→
PCR
引物?????? ①5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇
②5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇
③5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇
④5＇-TCATGAGCGCATAGTT-3＇??? ]
分別以①②③④為引物合成的片段F如圖5所示：
圖5
以①（或③）為引物合成的片段F經DNA連接酶連接成的環狀DNA如圖6甲所示，以④（或②）為引物合成的片段F經DNA連接酶連接成的環狀DNA如圖6乙所示。
甲???????? ?????????????????乙
圖6
圖6甲顯示以①（或③）為引物擴增形成的環狀DNA的末端為未知序列，再次擴增時，無法構建與之互補配對的引物，因而無法擴增出片段F的完整序列，而圖6乙顯示以④（或②）為引物擴增形成的環狀DNA的起始端和末端均為已知序列，因此，可以根據已知序列來設計引物，從而擴增出片段F的完整序列。
答案：②④
（七）目的基因的長度控制
在PCR中，含有目的基因的片段的長度，也是由引物與模板鏈結合的位置來決定的。引物分別從兩條模板鏈的3＇端結合上去，根據典例1解析中的圖示，擴增到第三輪時出現了兩條鏈等長的DNA片段，這也是最短的DNA片段。隨著循環次數的增加，這樣的DNA片段越來越多，當循環次數較多時，最終只有2個DNA片段的兩條鏈不等長，其余均為兩條鏈等長的DNA片段，而兩條鏈等長的DNA片段的每條鏈的5＇端分別為引物A和引物B，即此DNA片段的長度是由一對引物與模板鏈結合的位置來決定的。
二、酶切片段分析
酶切片段分析涉及幾種不同的限制酶在切割質粒時彼此之間相對位置的確定、酶切后所產生的片段長度等。
【典例4】圖7是限制酶BamHⅠ與BglⅡ的識別序列及切割位點示意圖；
圖8表示質粒pZHZ11（總長為3.8 kb，1 kb=1000對堿基）的結構，其中Apr為鏈霉素抗性基因；
lacZ為藍色顯色基因（基因表達的產物將無色化合物X-gal轉化為一種藍色物質，菌落呈藍色，否則為白色），請分析回答問題：
圖7???? ?????????????????????????????????圖8
（1）圖8中若將兩端分別用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切開的單個目的基因片段置換pZHZ11中0.5 kb的BamHⅠ酶切片段，形成4.9 kb的重組質粒，則目的基因的長度為?????????????????? kb。
（2）上述4.9 kb的重組質粒有兩種形式，若用BamHⅠ和EcoRⅠ聯合酶切其中一種，只能獲得1.6 kb和3.3 kb兩種DNA片段；
那么用聯合酶切同等長度的另一種重組質粒，則可獲得????????????????? ?kb和?????????????????? kb兩種DNA片段。
解析：（1）質粒pZHZ11的總長為3.8 kb，將兩端分別用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切開的單個目的基因片段置換pZHZ11中0.5 kb的BamHⅠ酶切片段，形成4.9 kb的重組質粒，則目的基因的長度=4.9 kb-（3.8 kb-0.5 kb）=1.6 kb。
（2）BamHⅠ酶切產生的黏性末端為[-G?????????? -CCTAG]和[GATCC-??????????? G-]，BglⅡ酶切產生的黏性末端為[-A?????? ????-TCTAG]和[GATCT-?????????? A-]，可見這兩種限制酶切割DNA分子后，產生的黏性末端是相同的，DNA連接酶能將它們切割產生的DNA片段連接起來，但在連接處形成的DNA片段為[-GGATCT--CCTAGA-]，它不能再被限制酶BamHⅠ和BglⅡ識別和切割了。因此，重組質粒有兩種類型：一種是目的基因被BamHⅠ酶切產生的黏性末端與圖8質粒pZHZ11上右側的BamHⅠ酶切產生的黏性末端相連接，另一種是目的基因被BamHⅠ酶切產生的黏性末端與圖8質粒pZHZ11上左側的BamHⅠ酶切產生的黏性末端相連接，分別形成圖9和圖10兩種重組質粒。
圖9
圖10
答案：（1）1.6 （2）1.7 3.2
三、變性、復性、延伸等環節的相關分析
PCR反應過程的基本環節一般包括高溫變性（90～95 ℃）→低溫退火（復性）（55～60 ℃）→適溫延伸（70～75 ℃）。一般要經歷30多次循環，每次循環可以分為變性、復性和延伸三步。
（一）變性與預變性的目的及要求
PCR在進行循環之前，常常要進行一次預變性。預變性一般為95 ℃ ，1～9 min；
變性一般為95 ℃，20～30 s。變性的目的是促使模板DNA分子的兩條鏈打開成為兩條單鏈，而預變性的目的也是增加大分子模板DNA徹底變性的概率。那可否直接在高溫變性環節延長時間呢？很明顯，不可以。如果在高溫變性環節時間過長，會導致DNA聚合酶的活性降低甚至失活，而在預變性之后加入DNA聚合酶，然后再設置變性、復性、延伸的溫度、時間及循環次數，就可避免這種影響。
（二）復性（退火）的目的及要求
復性，又稱為退火，目的是當溫度下降到55 ℃左右，使兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。復性一般為55～60 ℃ ，20～40 s。
（三）延伸的目的及要求
延伸是指溫度上升到70～75 ℃，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。延伸一般為72 ℃ ，5～15 min。很明顯，延伸環節是所有環節中用時最長的，這樣可以讓DNA聚合酶有充分的時間來催化DNA的合成。延伸環節為何選用處于三個環節的中間溫度72 ℃左右呢？其一，DNA聚合酶為耐高溫的Taq DNA聚合酶，為了保證其活性，溫度不能過低；
其二，高溫會導致引物與模板脫落，因此溫度不能過高。而PCR在最后一步，往往被設置成4 ℃，目的是讓DNA在從整個熱循環儀中取出來之前保持穩定。
［?? 參?? 考?? 文?? 獻?? ］
［1］? 任志鴻.十年高考分類解析與應試策略［M］.北京：知識出版社，2022.
［2］? 任志鴻.十年高考分類解析與應試策略［M］.海南：南方出版社，2013.
［3］? 楊建雄.分子生物學［M］.北京：化學化工出版社，2009.
（責任編輯 羅 艷）
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