李 倩 陳 臣 胡 燕 謝曉林 劉 濤
**醫科大學第四臨床醫學院，**烏魯木齊 830000
腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）為急性腦血管病的一種類型，預后很差，嚴重威脅人類健康及社會生產力[1-2]。在我國，ICH 所占比例很高，明顯高于西方國家，且給社會及家庭帶來沉重的經濟負擔[3-4]。ICH 后的炎癥反應是繼發性腦損傷的重要因素，小膠質細胞被認為是最早激活的炎癥效應細胞，活化的小膠質細胞有M1 和M2 兩種表型，不同表型的小膠質細胞起著損傷和保護的雙重作用，但這一雙重作用的病理改變及其具體機制尚不明確[5-6]。動物實驗研究發現，大黃能明顯改善急性期ICH 大鼠的神經功能缺損評分[7-8]。因此，本研究采用大黃的有效成分大黃酸，探討該藥對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導小膠質細胞極化表型及相關炎癥因子的影響。
1.1 材料
1.1.1 實驗細胞及藥物 小膠質細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司，小膠質細胞培養環境：MEM、10%FBS 及1%PS，37 ℃，5%CO2，飽和濕度。大黃酸購于上海麥克林生化科技有限公司（貨號：R817294）。
1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清[蘇州依科賽生物（ExCell Bio）科技股份有限公司，貨號：FND500]；
MEM培養基（美國Gibco 公司，貨號：FND500）；
腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司，貨號：70-EK182-96）；
白細胞介素（interleukin，IL）-6 ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司，貨號：70-EK106/2-96）；
IL-1β ELISA 試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司，貨號：70-EK101B-96）；
一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A014-1）；
Anti-Human CD86（B7-2）PE（杭州聯科生物技術有限公司，貨號：85-12-0869-41）；
Anti-Human CD206（MMR）PE-Cyanine7（杭州聯科生物技術有限公司，貨號：85-25-2069-41）。生物安全柜及CO2細胞培養箱（上海力康儀器有限公司，HF1200LC及Smart Cell HF-90）；
臺式低速離心機（上海安亭科學儀器有限公司，型號：TDL-60B）；
流式細胞儀（美國BD 公司，貨號：LSRFortessa）。
1.2 實驗方法
1.2.1 CCK-8 檢測細胞活力 取生長狀態良好的小膠質細胞，制備成5×104個/ml 單細胞懸液，接種至96孔板中（100 μl/孔），培養過夜細胞貼壁后，取生長狀態良好，匯合率達90%的小膠質細胞，胰酶消化細胞后，用培養基制備成5×104個/ml 單細胞懸液，接種至培養板中，置37 ℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養24 h 待細胞貼壁后，將細胞分為7 組，每組5個復孔。空白組以完全培養基常規培養，LPS 組加入1 μg/ml LPS 誘導4 h，不同大黃酸組分別用0.1、1、10、20、50 μmol/L 大黃酸預處理2 h 后，加入1 μg/ml LPS 誘導4 h[9]。干預完成后，收集上清，各孔加入100 μl 10%的CCK-8 溶液，并在培養箱中繼續孵育，在1 h后，使用酶標儀檢測450 nm 處的OD 值。
1.2.2 細胞形態觀察 根據CCK-8 檢測結果，最終確定大黃酸低、中、高劑量組分別為1、10、20 μmol/L，即分為空白組，LPS 組，大黃酸低、中、高劑量組，每組3個復孔。干預完成后，放置于倒置顯微鏡上，觀察小膠質細胞形態，并取3 個視野拍照。
1.2.3 流式細胞術檢測細胞中CD86+（M1 型）和CD206+（M2 型）的比例 按上述干預完成后，收集細胞，PBS 重懸洗滌2 次，離心，棄上清。加入PBS 計數至1×107/ml，吸取100 μl 細胞懸液至流式管中，每管加入5 μl CD86-PE、CD206 PE-Cy7 抗體；
4 ℃避光孵育20 min，離心，棄上清，用400 μl 預冷的PBS 重懸細胞，過200 目無菌篩網；
上流式細胞儀檢測CD86+、CD206+細胞比例。
1.2.4 采用ELISA 檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量 取上述分組細胞上清液，進行TNF-α、IL-1β、IL-6 含量檢測，參考試劑盒方法進行試劑配置，將各種試劑移至室溫平衡至少0.5 h，加入300 μl 洗液靜置浸泡30 s，棄洗液將微孔板拍干，標準孔加入100 μl，2 倍倍比稀釋的標準品。空白孔加入100 μl 培養基，樣本孔加入100 μl 細胞培養上清，每孔加50 μl 稀釋的檢測抗體，室溫孵育1.5 h，棄液，每孔300 μl 洗液洗板6 次，每孔加100 μl 稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，室溫孵育30 min。再次封板振蕩室溫孵育1.5 h，每孔加100 μl 顯色底物，避光室溫孵育5～30 min，每孔加100 μl 終止液，顏色出現變化，30 min 內使用酶標儀進行雙波長檢測。
1.2.4 細胞中誘導型NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）水平檢測 取生長狀態良好匯合率達90%的小膠質細胞，用完全培養基制備成5×104個/ml 單細胞懸液，接種至6 孔板中（2 ml/孔），培養過夜細胞貼壁后，按照上述實驗方法進行干預，同時準備對照組細胞，每組6 個復孔；
干預完成后，收集細胞進行iNOS 含量檢測，參考試劑盒相關方法。
1.3 統計學方法
采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。
2.1 大黃酸干預后HMC3 增殖情況
大黃酸各濃度組OD 值與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。
表1 大黃酸干預后HMC3 增殖情況（）
表1 大黃酸干預后HMC3 增殖情況（）
注LPS：脂多糖。
2.2 細胞形態情況
各組HMC3 細胞形態均正常。見圖1。
圖1 不同濃度大黃酸干預后HMC3 細胞形態（n=3）
2.3 流式細胞術檢測細胞中CD86+和CD206+的比例情況
與空白組比較，LPS 組CD86+表達量升高，CD206+表達量降低（P＜0.05）；
與LPS 組比較，大黃酸中、高劑量組CD86+表達量降低，CD206+表達量升高（P＜0.05）；
與大黃酸低劑量組比較，大黃酸中、高劑量組CD86+表達量降低、CD206+表達量升高（P＜0.05）。見圖2、表2。
圖2 流式檢測各組細胞表面CD86+、CD206+比例（n=3）
表2 大黃酸干預后各組細胞中CD86+、CD206+表達情況（%，）
表2 大黃酸干預后各組細胞中CD86+、CD206+表達情況（%，）
注 與空白組比較，aP＜0.05；
與LPS 組比較，bP＜0.05；
與大黃酸低劑量組比較，cP＜0.05。LPS：脂多糖。
2.4 大黃酸干預后各組IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達量比較
與空白組比較，LPS 組中IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量升高（P＜0.05）。與LPS 組比較，大黃酸中、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量降低（P＜0.05）。與大黃酸低劑量組比較，大黃酸中、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α 低表達量降低（P＜0.05）。見表3。
表3 大黃酸干預后各組中IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量比較（）
表3 大黃酸干預后各組中IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量比較（）
注 與空白組比較，aP＜0.05；
與LPS 組比較，bP＜0.05；
與大黃酸低劑量組比較，cP＜0.05；
IL：白細胞介素；
TNF-α：腫瘤壞死因子-α：LPS：脂多糖。
2.5 大黃酸干預后各組iNOS 活性檢測結果比較
與空白組比較，LPS 組iNOS 表達量升高（P＜0.05）。與LPS 組比較，大黃酸低、中、高劑量組iNOS 表達量降低（P＜0.05）。見表4。
表4 大黃酸干預后各組iNOS 活性檢測結果比較（）
表4 大黃酸干預后各組iNOS 活性檢測結果比較（）
注 與空白組比較，aP＜0.05；
與LPS 組比較，bP＜0.05。iNOS：誘導型一氧化氮合酶；
LPS：脂多糖。
ICH 屬中醫學“中風”范疇。該病多由肝腎虧虛、肝陽上亢、臟腑氣血逆亂、腦絡受損所致，臨床上多伴有大便秘結，腑氣不通，證屬本虛標實，“痰瘀交結，氣血逆亂，腑氣不通”是其急性期病機關鍵[10-11]。此病病機雖復雜，然不外乎風、火、氣、虛、痰、瘀，同時該病多以肝腎虧虛為本，屬本虛標實[12-13]。腦者元神之腑，其氣與臟腑之氣相通，臟腑功能逆亂易突發該病，且元神亦易被風、火、痰、瘀所侵擾，致“痰瘀交結，氣血逆亂，腑氣不通”。《神農本草經》首次提到大黃，功效“下瘀血，……蕩滌腸胃，推陳致新”。因此，急性中風即投此藥，則腑氣暢通，升降歸位，氣血條暢，顱壓得降，血腫消退，諸癥皆消。
當發生ICH 時，小膠質細胞是首先被激活的炎癥效應細胞，活化的小膠質細胞能夠分泌大量的趨化因子、炎癥因子、蛋白酶、其他細胞毒性產物，增加炎癥細胞聚集，出現炎癥放大級聯效應，加重神經損傷[14-15]。活化的小膠質細胞可以分為M1 和M2 兩種表型，M1樣表型的激活主要發生在ICH 急性期，M2 樣表型發生在亞急性和慢性期，有助于吞噬細胞碎片和血腫清除[16-17]。研究發現，腦出血后3～6 h M1 型小膠質細胞數量明顯上升，而M2 型小膠質細胞升高晚1 d 且持續時間更短[18]。在ICH 中驅動小膠質細胞向M2 極化，可以減輕炎癥反應達到神經保護的作用[19-20]。丁苯酞可以促進小膠質細胞M2 極化，從而減輕ICH 炎癥損傷[21]。此外，抑制小膠質細胞炎癥反應和自噬，能夠顯著減輕ICH 小鼠腦水腫，改善其神經功能[22-23]。本研究發現，大黃酸在干預LPS 誘導的小膠質細胞極化表型中M1 比例較低，而M2 型比例較高，下調IL-1β、IL-6、TNF-α 高等炎癥因子表達。由此可見，大黃酸通過抑制其向M1 表型轉化或誘導其向M2 表型轉化，從而減輕ICH 后炎癥反應。
iNOS 作為誘導酶，產生的一氧化氮能夠導致氧化應激和腦水腫，在神經系統炎癥反應中發揮作用重要[24]。研究表明抑制iNOS 的表達，能有效改善ICH 大鼠神經功能[25]。瑞芬太尼抑制了iNOS 的表達，亦能改善大鼠腦缺血再灌注損傷的神經功能[26]。本研究中大黃酸干預LPS 誘導的小膠質細胞后，iNOS 表達下調，與同行研究結果一致。此研究結果，可為ICH 的治療提供一定的理論基礎，亦為今后的臨床研究提供一種思路或選擇。
利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。
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