楊芳芳,李睿慧,王建杰
(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)
目前,全球乳腺癌的發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì),特別是在發(fā)展中國(guó)家。在中國(guó),乳腺癌也是女性中最常見的惡性腫瘤之一[1,2]。因此,進(jìn)一步研究乳腺癌的分子機(jī)制并為其提供有效的治療方案變得尤為重要。目前發(fā)現(xiàn),BACH 1是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,它通過(guò)抑制HO-1的表達(dá)在氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)中起著重要作用。BACH 1在核內(nèi)與HO-1啟動(dòng)子AREs緊密結(jié)合,從而抑制HO-1的表達(dá)。越來(lái)越多的研究表明BACH 1和HO-1在腸癌、肺癌、乳腺癌等癌癥中的異常表達(dá)有助于腫瘤的轉(zhuǎn)移[3,4]。丹皮酚是中藥牡丹皮中的活性成分,具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種活性。研究顯示,丹皮酚對(duì)多種腫瘤的細(xì)胞增殖均具有抑制作用。先前研究表明,丹皮酚對(duì)EMT6乳腺癌小鼠和人MCF-7乳腺癌細(xì)胞具有抑制作用,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)乳腺癌相關(guān)信號(hào)通路,其涉及了活化Caspase3和改善小鼠免疫功能等[5-7]。而丹皮酚的抗腫瘤作用是否通過(guò)調(diào)控BACH 1、HO-1的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)還未見報(bào)道。
1.1 材料
收集2017年9月至2018年7月在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院和佳木斯市中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的114例女性乳腺癌患者所切除的癌組織和癌旁組織標(biāo)本,并取得了患者知情同意和倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。獲得其臨床病理學(xué)特征,包括年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤分級(jí)和腫瘤轉(zhuǎn)移分期(TNM)?；颊呔鶠榕?年齡30～80歲,平均50.8歲。標(biāo)本由114個(gè)乳腺癌組織和30個(gè)匹配的癌旁(對(duì)照)組織組成。腫瘤轉(zhuǎn)移(TNM)分期標(biāo)準(zhǔn)參考世界衛(wèi)生組織2005年確定的腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。
1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
MDA-MB-468細(xì)胞株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所);丹皮酚(沈陽(yáng)藥科大學(xué));CCK-8試劑盒(碧云天生物公司);抗BACH 1、抗HO-1單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒(Santa Cruz公司);β-actin抗體(Abcam公司);SDS-PAGE(弗德公司);光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus公司)。
1.3 方法
1.3.1 免疫組織化學(xué)法
將組織樣本進(jìn)行固定后石蠟包埋,然后切片處理。一抗BACH 1(1:50)、HO-1(1:100)孵育過(guò)夜。二抗孵育20min后,滴加SABC使二抗結(jié)合物增強(qiáng)。DAB顯色,在光鏡下觀察并捕獲圖像。
1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
將MDA-MB-468細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng),隔天觀察,適時(shí)傳代。
1.3.3CCK-8檢測(cè)丹皮酚對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響
不同濃度丹皮酚處理MDA-MB-468細(xì)胞,接種于24孔板中培養(yǎng),每組5個(gè)平行孔,48h, PBS清洗重復(fù)三次,將無(wú)血清的培養(yǎng)基和CCK-8按10∶1配制試劑,每孔加入100μL試劑,培養(yǎng)箱孵育2h后將上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中,每孔設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,酶標(biāo)儀450nm時(shí)測(cè)定吸光度OD值。
1.3.4Transwell法檢測(cè)MDA-MB-468細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力
無(wú)血清培養(yǎng)基輕柔重懸細(xì)胞(6×104個(gè)/mL),取200μL(0.2mL)稀釋的細(xì)胞懸液于小室中。取600μL 20%完全培養(yǎng)基加至小室下方24孔培養(yǎng)板中,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用95%酒精固定,0.1%的結(jié)晶紫染色15min。顯微鏡下觀察穿膜數(shù)并拍照。
1.3.5Westernblot檢測(cè)MDA-MB-468細(xì)胞BACH1、HO-1的表達(dá)
提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白,按照BCA試劑盒步驟操作。轉(zhuǎn)膜,封閉后加入抗體β-actin(1:1000)、BACH 1(1:1000)、HO-1(1:2000),4℃過(guò)夜。將膜放于二抗中搖床上孵育1h。TBST清洗后,成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶,并導(dǎo)出圖片。應(yīng)用LabWork 3.0 UVP軟件計(jì)算蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較t檢驗(yàn),多組間比較F檢驗(yàn)。臨床參數(shù)使用χ2分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 癌組織中BACH 1、HO-1表達(dá)
BACH 1、HO-1在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)情況,見圖1。與對(duì)照組(圖1A)相比,BACH 1(圖1B)表達(dá)降低。HO-1與對(duì)照組相比表達(dá)升高(圖1C、D)。
A.乳腺癌旁組織中BACH 1; B. 乳腺癌組織中的BACH 1;C. 乳腺癌旁組織中 HO-1;D. 乳腺癌組織中的 HO-1。數(shù)據(jù)來(lái)自每張玻片隨機(jī)3～5個(gè)視野。
2.2 BACH 1、HO-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
在114例乳腺癌組織中,44例BACH 1高表達(dá),70例低表達(dá),HO-1 76例高表達(dá),38例低表達(dá)。通過(guò)分析BACH 1、HO-1的表達(dá)情況與臨床資料之間的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BACH 1與腫瘤TNM分期顯著相關(guān),HO-1表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)顯著相關(guān)(P<0.05),見表1。
表1 BACH 1、HO-1的表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(%)
2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖
不同濃度的丹皮酚處理MDA-MB-468細(xì)胞48 h,發(fā)現(xiàn)60mg/L的Pae對(duì)于乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的抑制作用(P<0.05,vs對(duì)照組),后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作將用60mg/L濃度。
2.4 Transwell法檢測(cè)丹皮酚處理MDA-MB-468細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力
與對(duì)照組細(xì)胞相比,丹皮酚處理后細(xì)胞小室基底膜的細(xì)胞數(shù)目下降。因此認(rèn)為丹皮酚,對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力有抑制作用,見圖2。
A.對(duì)照組; B.丹皮酚組
2.5 丹皮酚對(duì)細(xì)胞BACH 1、HO-1蛋白表達(dá)的影響
應(yīng)用Western Blot分析BACH 1、HO-1蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比,BACH 1表達(dá)上調(diào),HO-1表達(dá)減弱,見圖3。
A. Western印跡法以β-actin作為對(duì)照BACH1和HO-1的表達(dá); B. 蛋白相對(duì)表達(dá)水平(n=3,表示±SD)*P <0.05對(duì)照。
本研究通過(guò)對(duì)乳腺癌患者癌組織與癌旁組織BACH 1與HO-1表達(dá)檢測(cè)并分析其與臨床特征的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中BACH 1低表達(dá),而非癌組織中只有20%BACH1低表達(dá),并發(fā)現(xiàn)低BACH 1表達(dá)與腫瘤分期顯著負(fù)相關(guān)。而HO-1高表達(dá)與腫瘤分級(jí)有關(guān),低分化腫瘤HO-1表達(dá)高于高/中分化腫瘤。BACH 1為一種轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞周期中對(duì)很多基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控,在細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。可以被看作為腫瘤抑制因子。研究報(bào)道,BACH 1負(fù)調(diào)節(jié)HO-1的表達(dá)以抑制細(xì)胞凋亡并增加癌細(xì)胞增殖。BACH 1低表達(dá)促進(jìn)乳腺癌進(jìn)程。BACH 1的下調(diào)可能是由于血紅素水平升高促使HO-1分解血紅素而減少細(xì)胞凋亡[8,9]。HO-1是一種細(xì)胞保護(hù)酶,HO-1在多種腫瘤組織中高表達(dá),包括乳腺癌、鼻咽癌和胃癌等[10,11],這與我們的研究結(jié)果一致,證明BACH 1低表達(dá)與HO-1高表達(dá)參與了乳腺癌的進(jìn)程。
乳腺癌的治療通常采用手術(shù)及術(shù)后的放、化療等,通常容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,中藥以副作用小、價(jià)格低廉為患者提供了希望。丹皮酚是牡丹皮中的有效成分,具有抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本研究結(jié)果顯示,丹皮酚能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變與凋亡指數(shù)的增加,并使低表達(dá)的BACH 1升高,高表達(dá)的HO-1降低,進(jìn)一步證明了丹皮酚的抗乳腺癌的作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且與調(diào)控BACH 1、HO-1相關(guān),為以BACH 1、HO-1為靶點(diǎn)治療乳腺癌提供了新思路。
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