鄧 倩,王奕凱,張思邈,尉嘯涵,郭大偉,劉曉曄,*,董 虹,*
(1.北京農學院 動物科學技術學院 獸醫學(中醫藥) 北京市重點實驗室,北京102206;2.北京農學院 動物科學技術學院 北京市中獸藥工程技術研究中心,北京 102206)
大腸桿菌是臨床上最常見的一種革蘭陰性菌,能引起多種動物病理性感染[1]。有研究表明,大腸桿菌可以引起家禽群的局部或全身感染以及引起全身性急性奶牛乳房炎,能夠破壞仔豬腸道屏障進而降低斷奶仔豬的生長性能,同時也是引起人類腹瀉的主要原因之一[2-5]。因此,大腸桿菌感染給養殖業和人類健康造成巨大的經濟損失和生命安全威脅。
大腸桿菌可以損傷腸道屏障,ZO-1經常被用于評估腸道屏障的損傷程度,也是腸道屏障緊密連接的一個主要標記蛋白[6-7],起著維持整個細胞通透性的作用[8-9]。當ZO-1表達降低時,提示細胞屏障可能遭到破壞,與此同時,細菌和細菌毒力因子也更容易進入到細胞內造成進一步的損傷。所以,當受到大腸桿菌感染時,恢復ZO-1的正常表達對腸道屏障功能至關重要。
清熱涼血方是由2味及2味以上單味藥組成的方劑,廣泛的作用靶點是相比于其他藥物所具有的獨特優勢之一[10-11]。清熱涼血方講究的是“扶正”和“祛邪”,一方面可以通過靶向細菌產生抗菌作用,同時也可以通過靶向宿主產生抗菌作用,雙效齊下,恢復機體陰陽平衡[12]。清熱涼血方是否可以防治大腸桿菌引起的緊密連接ZO-1蛋白損傷目前尚不清楚。
本研究探究清熱涼血方對大腸桿菌的直接抑菌作用以及大腸桿菌對緊密連接ZO-1蛋白損傷的防治作用。此外,還進一步檢測了清熱涼血方中含有的有效活性成分,為下一步對清熱涼血方抗菌的研究奠定基礎。
1.1 細菌和細胞大腸桿菌(ATCC25922)和IPEC-J2均來自本實驗室自行凍存。所有細胞和細菌均在含有5% CO2的37℃培養箱中培養。
A.白頭翁湯;B.牛角地黃湯;C.清營湯;D.清瘟敗毒飲
A.清熱涼血方預防處理后ZO-1表達變化;B.清熱涼血方治療處理后ZO-1表達變化。
ns.P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01。下同
A.細胞熒光拍攝結果;B.ZO-1蛋白熒光強度量化
1.2 主要試劑及藥材改良馬丁培養基(生產批號:02-037)購自北京奧博星生物技術有限責任公司;硝酸鋁(貨號:A800886)、三氯化鐵(貨號:I811935)、苯酚(貨號:P815401)購自上海麥克林生化科技有限公司;ZO-1 Monoclonal Antibody(貨號:339188)購自ThermoFisher公司;2xReal-time PCR Super Mix(貨號:MF013-01)購自北京聚合酶生物科技有限公司;白頭翁(生產批號:20201223)、黃連(生產批號:2105202)、黃柏(生產批號:210505001)、生地(生產批號:B7291411)、水牛角(生產批號:B8051441)、甘草(生產批號:200516)購自北京同仁堂。
1.3 清熱涼血方水提液制備制備4付清熱涼血方水提液。4付清熱涼血方組成如圖1所示,白頭翁湯:白頭翁6 g、黃連9 g、黃柏9 g、秦皮9 g;牛角地黃湯:水牛角30 g、生地24 g、芍藥9 g、丹皮6 g;清營湯:水牛角9 g、生地15 g、玄參9 g、麥冬9 g、連翹6 g、金銀花9 g、黃連5 g、竹葉3 g、丹參6 g;清瘟敗毒飲:石膏30 g、知母12 g、甘草12 g、水牛角6 g、生地6 g、芍藥12 g、牡丹皮12 g、黃連3 g、黃芩12 g、連翹12 g、梔子12 g、玄參12 g、竹葉12 g、桔梗12 g。按劑量配比好后,加入足量蒸餾水,浸泡30 min。用武火煮沸后改為文火繼續煎煮20 min,使用4層紗布趁熱過濾后收集藥液。繼續向剩余的藥渣加入足量蒸餾水,重復上述步驟1次,最后將2次所得的濾液合并,利用旋轉蒸發儀將藥液進行濃縮,使最后生藥的質量濃度為1 g/mL。
1.4 菌液的制備將活化后的大腸桿菌菌液進行離心,棄掉上清液,用0.9%生理鹽水重懸,使用比濁管進行細菌計數。使用時用培養基進行稀釋備用。
1.5 最小抑菌濃度(MIC)測定采用試管法進行MIC測定。取40支試管,10支為1組進行編號。將藥液以2倍稀釋加入到1～8號試管,即質量濃度為1 000.000 0,500.000 0,250.000 0,125.000 0,62.500 0,31.250 0,15.625 0,7.812 5 g/L。再按1∶1加入濃度為2×105CFU/mL的菌液。第9號試管只加藥,不加菌,用作藥物對照。第10號試管只加菌,不加藥,用作細菌對照。37℃恒溫培養箱過夜培養。
1.6 IPEC-J2培養及分組使用細胞計數器將細胞密度調整為1×106個/孔,待細胞長到80%～90%開始試驗。試驗分為6組。空白對照組、大腸桿菌組、白頭翁湯組、牛角地黃湯組、清營湯組和清瘟敗毒飲組。預防處理時,空白對照組加入維持培養基(含2%血清的DMEM)作用16 h;大腸桿菌組加入維持培養基作用12 h,12 h后加以入大腸桿菌1×108CFUs/孔作用4 h;其余各組先加清熱涼血方作用12 h,12 h后處理同大腸桿菌組。治療處理時,空白對照組加入維持培養基作用16 h,大腸桿菌組和剩余其他組加入1×108CFUs/孔的大腸桿菌作用4 h,4 h后大腸桿菌組換成維持培養基作用12 h。其他各組加入對應清熱涼血方作用12 h。
1.7 RT-qPCR反應將反應完成后的細胞用PBS清洗3次,使用TRIzol法提取細胞總RNA。按照Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒說明書步驟逆轉錄合成cDNA。按2×Real-time PCR Super Mix試劑盒說明書步驟進行RT-qPCR。引物設計參考文獻[13],具體見表1。
表1 RT-qPCR 引物
1.8 免疫熒光染色檢測將反應完成后的細胞用PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,再用PBS清洗3遍,3% BSA室溫孵育1 h進行封閉;封閉結束后直接孵育ZO-1熒光一抗3 h,再用PBS清洗3遍,孵育Actin 30 min,再用PBS清洗3遍,孵育DAPI 5 min,最后用PBS清洗3遍,封片,熒光顯微鏡拍攝。
1.9 活性成分含量測定精密稱取蘆丁、沒食子酸、葡萄糖等標準品配置成質量濃度為0.2 g/L標準樣品溶液。再將標準樣品溶液進行不同質量濃度的稀釋,于D510 nm、D760 nm以及D490 nm處測定吸光度值。分別以蘆丁、沒食子酸、葡萄糖標準品溶液質量濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。將清熱涼血方稀釋成20 g/L,按上述標準曲線制備方法進行測定,并由標準曲線或回歸方程計算樣品中總黃酮、總酚酸、總多糖含量[13-15]。
2.1 清熱涼血方對大腸桿菌MIC測定結果清熱涼血方本身的顏色是影響MIC判斷的主要原因,因此本試驗在培養基中加入微量酚紅(0.02%),通過細菌和清熱涼血方共孵育后的顏色變化來確定MIC值。4付清熱涼血方對大腸桿菌的MIC測定結果見表2,結果表明白頭翁湯、牛角地黃湯和清瘟敗毒飲對大腸桿菌的MIC最低,說明抑菌作用最強,其次是清營湯。
表2 4付中藥復方水提取液對大腸桿菌的 MIC值 g/L
2.2 清熱涼血方對ZO-1 mRNA表達的影響為了驗證4付清熱涼血方對ZO-1 mRNA表達的影響,使用RT-qPCR對ZO-1進行定量分析,結果如圖2所示。在進行預防處理和治療處理時,與空白對照組相比,大腸桿菌組中ZO-1 mRNA的表達顯著降低(P<0.05),表明大腸桿菌能夠對細胞造成損傷,說明造模成功;使用清熱涼血方預防處理有助于細胞抵抗大腸桿菌的侵襲。其中牛角地黃湯效果最好(P<0.01),白頭翁湯和清瘟敗毒飲效果次之(P<0.05)(圖2A)。說明牛角地黃湯對大腸桿菌的侵襲有很好的預防作用。攻菌后,再使用中藥復方水提液有助于恢復ZO-1 mRNA的表達,牛角地黃湯和清瘟敗毒飲效果最好(P<0.01),白頭翁湯效果次之(P<0.05)(圖2B)說明牛角地黃湯和清瘟敗毒飲對大腸桿菌侵襲有很好的治療作用。
2.3 清熱涼血方預防處理對ZO-1蛋白表達的影響蛋白是mRNA轉錄和翻譯后的產物,執行不同的細胞功能。于是將細胞制作成細胞爬片,待作用結束后進行固定和抗體孵育,使用激光共聚焦顯微鏡對ZO-1蛋白的熒光強度進行定量分析。結果表明,與空白對照組相比,大腸桿菌組中ZO-1 蛋白表達顯著降低(P<0.05),說明造模成功;與大腸桿菌組比較,白頭翁湯組、清營湯組和清瘟敗毒飲組中ZO-1 蛋白表達顯著升高(P<0.05)(圖3A為熒光結果,圖3B為結果量化);說明白頭翁湯、清營湯和清瘟敗毒飲可以通過保護細胞抗大腸桿菌對ZO-1的破壞。
2.4 清熱涼血方治療處理對ZO-1蛋白表達的影響探究大腸桿菌預處理4 h后4付清熱涼血方對ZO-1蛋白表達的影響。結果顯示,大腸桿菌組與空白對照組相比,大腸桿菌組中ZO-1 蛋白表達極顯著降低(P<0.001),表明模型構建成功;其他用藥組與大腸桿菌組比較,清瘟敗毒飲組和牛角地黃湯組可以極顯著恢復ZO-1蛋白的表達(P<0.01,P<0.001),而白頭翁湯組和清營湯組與大腸桿菌組相比差異不顯著(P>0.05);說明清瘟敗毒飲和牛角地黃湯可以治療大腸桿菌對ZO-1蛋白造成的損傷,并且清瘟敗毒飲效果最好。
2.5 清熱涼血方中有效活性成分含量的檢測根據前期試驗結果,為了進一步探究清熱涼血方具有預防和治療大腸桿菌損傷的原因。檢測清熱涼血方中是否含有具有抗菌、抗炎、免疫調節等藥理作用的有效活性成分。通過硝酸鋁顯色法、硫氰化鉀-三氯化鐵法以及濃硫酸-苯酚法檢測總黃酮、總酚酸、總多糖的含量。結果顯示,白頭翁湯、牛角地黃湯、清營湯和清瘟敗毒飲中均含有一定量的總黃酮、總酚酸以及總多糖成分。其中,總黃酮和總酚酸含量最高的是白頭翁湯,分別為120.75,58.11 mg/g;總多糖含量最高的是牛角地黃湯為370.02 mg/g(圖5)。說明清熱涼血方含有多種有效成分,不單單只通過一種成分來發揮預防和治療作用。
隨著抗生素的廣泛使用,造成多重耐藥(MDR)細菌的出現,因此,需要尋找新的抗菌策略[16]。天然植物中含有大量有效活性成分,具有多種生物活性[17]。研究發現,迷迭香提取物能夠降低大腸桿菌攻毒肉雞的腹瀉率,從線葉金雀花中提取的總黃酮以及黃連、蘇木、五味子的水提液對大腸桿菌都有很好的抑菌效果[18-22]。但在臨床的應用中,中藥復方的使用頻率更高。中藥復方具有一定結構、多層次、多作用靶點等特點。因此,本研究選取4付經典的清熱涼血方進行探究,以期為臨床治療大腸桿菌用藥提供參考。
清熱涼血方由于具有顏色不利于對MIC的直接判斷。本研究中使用加入微量酚紅改良的馬丁培養基,預先將清熱涼血方調整至中性,細菌生長繁殖中消耗培養基中的葡萄糖,使溶液呈酸性,酚紅在酸性環境中呈黃色來進行判定。試驗結果表明,白頭翁湯、牛角地黃湯、清營湯和清瘟敗毒飲均有一定直接抗菌作用,其中抗菌效果最好的是清瘟敗毒飲、白頭翁湯和牛角地黃湯。
進一步地有研究表明,大腸桿菌在臨床上主要引起犢牛、仔豬以及兒童腹瀉,損傷腸道屏障[23-25]。緊密連接是腸道屏障最重要的一個組成部分。竇彩霞等[26]在研究中發現,腸產毒素大腸桿菌處理細胞可以極顯著降低ZO-1的表達,引起細胞損傷,破壞緊密連接。因此,本研究聚焦于探究清熱涼血方對大腸桿菌損傷細胞ZO-1的防治作用,同時,也證實了大腸桿菌標準株同樣也能造成ZO-1表達的降低。
使用清熱涼血方對細胞進行預防和治療處理,再檢測ZO-1 mRNA的表達和免疫熒光強度。結果表明,清熱涼血方有很好的預防和治療作用,其中預防作用最好的是白頭翁湯、清營湯和清瘟敗毒飲,治療效果最好的是清瘟敗毒飲。這與mRNA的表達并不完全相同。這可能是由于mRNA在轉錄和翻譯的過程中發生了改變,研究表明蛋白是執行各種任務以維持生命的主力分子,所以蛋白最后的表達情況更具有參考價值[27]。并且在預防作用中,清熱涼血方直接靶向細胞本身,通過增加細胞ZO-1的表達來抵抗大腸桿菌的侵襲,這與傳統靶向細胞本身的抗菌方式有所區別,這也體現出清熱涼血方具有“扶正和祛邪”優勢[12]。
有效活性成分是清熱涼血方能夠發揮生物活性的最主要原因。分別檢測4付清熱涼血方中的總黃酮、總酚酸以及總多糖含量。結果表明,4付清熱涼血方中均含有這3類有效活性成分,這也說明清熱涼血方中含有大量不同種類的有效活性成分,這些有效活性成分相輔相成,最終起到抗大腸桿菌引起的ZO-1蛋白降低的作用。
根據以上結論可以得出,4付清熱涼血方有直接抑菌作用,并且通過提高ZO-1蛋白的表達進而具有預防和治療大腸桿菌損傷細胞作用。除此之外,清熱涼血方中含有多種有效活性成分,所以發揮作用的機制可能是多方面的,具體還需更進一步研究。
猜你喜歡 牛角黃湯白頭翁 當歸六黃湯治療假體周圍骨折術后低熱疑似感染1例基層中醫藥(2022年1期)2022-07-22彎彎月亮像牛角黃河之聲(2022年5期)2022-06-21白頭翁雪豆月讀·高年級(2021年11期)2022-01-01當歸六黃湯 傳承七百年特別健康(2018年2期)2018-06-29牛角掛書小天使·二年級語數英綜合(2017年4期)2017-04-18一看書就犯困兒童故事畫報·發現號趣味百科(2015年6期)2015-08-17想改名的白頭翁科學啟蒙(2014年4期)2015-01-19三黃湯合當歸六黃湯加味治療糖尿病合并肺炎1例中國中醫藥現代遠程教育(2014年20期)2014-03-01芍藥地黃湯加味治療帶狀皰疹55例實用中醫藥雜志(2014年3期)2014-03-01白頭翁研究進展中成藥(2014年11期)2014-02-28