趙一帆, 羅 磊, 馬 瀟, 劉浩宇
(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,洛陽(yáng) 471023)
綠豆在我國(guó)有2000余年的種植史,種植地區(qū)非常廣泛[1]。綠豆皮是綠豆加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物,綠豆皮中含有大量的膳食纖維及各種活性成分[2-7]。但綠豆皮中纖維素的含量較高[8]、難以粉碎至口感較好的程度,導(dǎo)致綠豆皮本身的良好保健功能難以表現(xiàn),大部分綠豆皮被棄置或用于牲畜飼料[9],這大大浪費(fèi)了其價(jià)值。傳統(tǒng)的制粉方法主要采用螺桿擠壓、超微粉碎、高溫高壓等方法來(lái)破壞綠豆皮結(jié)構(gòu),但都存在需求大型設(shè)備、耗能較高、成本較高等問(wèn)題。
微生物法具有能耗低、成本低廉等優(yōu)勢(shì)。且微生物本身分泌的多種酶類能夠有效破壞綠豆皮的植物細(xì)胞壁[10]。使用微生物法來(lái)改善高纖維作物加工產(chǎn)品有較好的作用。徐安民[11]使用白腐菌固態(tài)發(fā)酵麥麩中的木質(zhì)纖維素來(lái)改善小麥麩皮面條的粗糙口感,Wu等[12]使用米曲根瘤菌改善麥麩風(fēng)味的同時(shí)也增加了其淀粉消化率,裴曾薇[13]對(duì)香菇柄膳食纖維使用黑曲霉改性后持水力、持油力、葡萄糖吸附能力等理化特性均得到提升。黑曲霉作為一種常見發(fā)酵曲霉,已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,其能產(chǎn)生多種酶如纖維素酶、木聚糖酶、糖化酶等,且不產(chǎn)生真菌毒素[14]。
本研究用黑曲霉對(duì)綠豆皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,并以體積平均徑、比表面積為指標(biāo),考察制粉特性的改善,持水力、持油力、膨脹力、溶解性、膽酸鈉吸附能力、陽(yáng)離子交換能力及葡萄糖吸附能力為指標(biāo),考察綠豆原皮(GY)與黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后綠豆皮(GH)的理化特性提升。采用掃描電鏡、X射線衍射及紅外光譜法考察黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對(duì)綠豆皮微觀結(jié)構(gòu)與化學(xué)鍵的影響,初步探究綠豆皮被降解的機(jī)理,以期為提高綠豆皮利用率以及擴(kuò)寬其應(yīng)用面提供參考。
1.1 菌種與樣品
黑曲霉(Aspergillusniger),為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;綠豆皮,洛陽(yáng)產(chǎn)。
1.2 試劑與設(shè)備
PDA營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂,生物試劑(BR);葡萄糖、凡士林、石蠟油、氯化鈉、溴化鉀,分析純(AR);牛膽酸鈉,化學(xué)純(CP)。
SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái),DHP9272電熱恒溫培養(yǎng)箱,YXQ-LS-50S自動(dòng)高壓滅菌鍋,T6紫外可見分光光度計(jì),BJ-150多功能粉碎機(jī),TM3030Plus臺(tái)式掃描電鏡,VERTEX70傅里葉變換中遠(yuǎn)紅外光譜儀,Xstress3000(G2)X射線衍射儀。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 工藝流程
取清洗、烘干后的綠豆皮50 g于1 L錐形瓶中,用透氣膜封口,于全自動(dòng)高壓鍋121 ℃下滅菌20 min后進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。取經(jīng)過(guò)菌種分解的綠豆皮,攤開后放入55 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干過(guò)夜。然后使用萬(wàn)能粉碎機(jī)對(duì)綠豆皮進(jìn)行粉碎后過(guò)125 μm篩網(wǎng),粉碎時(shí)間為2 min。收集粉末,放置在干燥器中于4 ℃冰箱保藏。
1.3.2 菌種活化及種子液的制備
黑曲霉孢子懸浮液的制備:參考吳紅影等[15]的方法并稍作修改。
1.3.3 綠豆皮發(fā)酵
在接種黑曲霉孢子量2×107個(gè)、溫度36 ℃、時(shí)間7 d、料液比1∶3的條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。
1.3.4 綠豆皮制粉特性的測(cè)定
粒徑分布及比表面積測(cè)定:取相同條件粉碎后的適量綠豆皮粉于燒杯,倒入激光粒度分布儀進(jìn)行測(cè)定,物質(zhì)折射率為1.52,介質(zhì)為水,折射率為1.33。為方便描述將綠豆原皮用GY表示,黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后綠豆皮用GH表示,余同。
1.3.5 綠豆皮理化特性測(cè)定
1.3.5.1 持水力測(cè)定
參照Tian等[16]的方法并稍作修改,計(jì)算持水力。
(1)
式中:WH為綠豆皮粉的持水力/g/g;m0為干燥樣品質(zhì)量/g;m1為離心管質(zhì)量/g;m2為離心管和沉淀質(zhì)量/g。
1.3.5.2 溶解性測(cè)定
參照王萍等[17]的方法并稍作修改,計(jì)算溶解性。
(2)
式中:WS為綠豆皮粉的溶解性/%;m0為樣品質(zhì)量/g;m1為平皿質(zhì)量/g;m2為烘干后的上清液和平皿質(zhì)量/g。
1.3.5.3 膨脹力測(cè)定
參照Oluwatoyin等[18]的方法并稍作修改,計(jì)算膨脹力。
(3)
式中:PL為綠豆皮粉的膨脹力/mL/g;V1為初始體積/mL;V2為溶脹后體積/mL;m0為樣品質(zhì)量/g。
1.3.5.4 持油力測(cè)定
參照Kurek[19]的方法并稍作修改,計(jì)算持油力。
(4)
式中:OH為綠豆皮粉的持油力/g/g;m2為離心管和樣品質(zhì)量/g;m1為離心管質(zhì)量/g;m0為樣品質(zhì)量/g。
1.3.5.5 陽(yáng)離子交換能力測(cè)定
參照Wei等[20]的方法稍作修改。
1.3.5.6 膽酸鈉吸附能力分析
膽酸鈉吸附能力測(cè)定:參照王雅琪[4]的方法稍作修改。
1.3.5.7 葡萄糖吸附能力分析
葡萄糖吸附能力測(cè)定:參照Peerajit等[21]的方法稍作修改。
1.3.6 綠豆皮降解機(jī)理研究
1.3.6.1 掃描電鏡觀測(cè)
將樣品臺(tái)放入掃描電鏡,抽真空并觀測(cè)。具體條件:加速電壓為 15 kV,模式為“Standard”,圖片掃描倍數(shù)為 80～500倍。
1.3.6.2 傅里葉紅外光譜掃描
將制得的樣品壓片在4 cm-1分辨率4 000～400 cm-1區(qū)間進(jìn)行掃描,掃描次數(shù)設(shè)置為64次,KBr做空白樣品,每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。
1.3.6.3 XRD射線衍射表征
對(duì)經(jīng)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵綠豆皮粉和原粉分別進(jìn)行X-射線衍射檢測(cè),具體條件:Cu 靶、管壓力為 40 kV、電流為 30 mA、掃描速率為2(°)/min、起始角:5°、終止角:90°、采樣步寬 0.05°。
1.3.6.4 綠豆皮主要組分變化
采用Van Soest 洗滌法并參考陳露露[22]的方法稍作修改進(jìn)行測(cè)定。
1.3.7 數(shù)據(jù)處理
每組樣品做3次平行實(shí)驗(yàn),取平均值,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),使用沃勒-鄧肯法進(jìn)行顯著性分析,利用Origin 2021軟件作圖,利用Design Expert 12軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。
2.1 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對(duì)綠豆皮制粉特性的影響
GY與GH的粒徑與表面積大小如表1所示,經(jīng)過(guò)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵,在相同粉碎條件下,綠豆皮粉的體積平均徑由391.05 μm顯著縮小到45.46 μm,減少了8.52倍。綠豆皮粉比表面積由8.51 m2/kg顯著提升至279.07 m2/kg,增加了32.46倍。這是由于固態(tài)發(fā)酵破壞了綠豆皮的結(jié)構(gòu),使其易被粉碎為粒徑更小的粉體。更小粒徑的綠豆皮粉末,會(huì)帶來(lái)更好的口感,改善綠豆皮制粉特性。
表1 綠豆皮粉的粒徑及比表面積
2.2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對(duì)綠豆皮理化特性的影響
2.2.1 水合特性
經(jīng)過(guò)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵的綠豆皮,溶解性得到顯著提升(表2),增加了11.22倍,可能是因?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵使綠豆皮中的一些大分子長(zhǎng)鏈的不溶性成分被降解為小分子短鏈的可溶性成分。而固態(tài)發(fā)酵后比表面積的增加,使更多小型基團(tuán)暴露,更易與水和油結(jié)合,持水力、膨脹力、持油力與陽(yáng)離子交換能力得到提升,分別增加了1.07、1.03、1.20倍和1.11倍。溶解性的提升說(shuō)明有更多的可溶性活性成分產(chǎn)生,而更高的持油力表明有更好的降血脂功能,陽(yáng)離子交換能力的提高更有助于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[23]。
表2 綠豆皮的水合特性
2.2.2 膽酸鈉吸附能力分析
對(duì)比吸附后上清液膽酸鈉濃度可以看出,GH中膽酸鈉溶液濃度要明顯低于GY(圖1),反應(yīng)120 min時(shí)測(cè)得GY膽酸鈉質(zhì)量濃度為0.59 mg/mL,GH中膽酸鈉質(zhì)量濃度為0.34 mg/mL,吸附能力提升了1.18倍。這可能是因?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵造成比表面積增大,使得更多基團(tuán)暴露,更易于膽酸鈉結(jié)合,同時(shí)更疏松的孔隙結(jié)構(gòu)也有利于膽酸鈉的吸附。對(duì)膽酸鈉的吸附有利于膽固醇的消化,有助于提升綠豆皮的降血脂作用。
圖1 膽酸鈉濃度變化圖
2.2.3 葡萄糖吸附能力分析
在相同葡萄糖濃度下,GH相較于GY的葡萄糖吸附量更大(圖2),在200 mmol/L的葡萄糖濃度下,GH的葡萄糖吸附能力提升了1.17倍。這說(shuō)明固態(tài)發(fā)酵使綠豆皮具有更好的葡萄糖吸附能力。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵后更高的可溶性膳食纖維形成膠質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將葡萄糖捕獲[24],同時(shí)更加疏松的結(jié)構(gòu)也更易吸附葡萄糖。而更強(qiáng)的降血糖能力,能夠有效預(yù)防高血糖與糖尿病等疾病[25],有助于綠豆皮應(yīng)用在保健食品中。
圖2 不同葡萄糖濃度對(duì)GY與GH吸附能力的影響
2.3 綠豆皮降解機(jī)理研究
2.3.1 掃描電鏡分析
從電鏡掃描圖可以看到(圖3),綠豆皮發(fā)酵前后發(fā)生明顯的變化,左側(cè)GY表面結(jié)構(gòu)完整均勻,僅有少量褶皺和空隙,而右側(cè)GH表面褶皺與孔隙明顯增多,并出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)。這說(shuō)明黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對(duì)綠豆皮的表面結(jié)構(gòu)造成了明顯破壞,其原因可能是纖維素、半纖維素的降解造成綠豆皮變得疏松多孔,這與符旭棟[26]使用微生物發(fā)酵改性檸檬皮渣的研究結(jié)論相似。
圖3 綠豆皮的掃描電鏡圖(×500)
2.3.2 傅里葉紅外光譜掃描結(jié)果及分析
通過(guò)對(duì)綠豆皮粉紅外光譜分析可知(圖4),3 330 cm-1出現(xiàn)較寬吸收譜帶是綠豆皮纖維素與半纖維素的O—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生,2 922 cm-1附近吸收峰為糖類亞甲基中C—H伸縮振動(dòng)[27],在1 321 cm-1處的吸收峰是木質(zhì)素組分的拉伸或彎曲特征峰,1 060 cm-1的較寬吸收是纖維素和半纖維素C—O、C—C、C—O—C的拉伸。從圖4中可以看到,GH和GY的紅外光譜基本一致,但GH纖維素、半纖維素及木質(zhì)素特征峰的吸收明顯減弱,這可能是黑曲霉固態(tài)發(fā)酵能夠部分破壞纖維素、木質(zhì)素等的化學(xué)鍵,并降解纖維素木質(zhì)素等不溶性膳食纖維成分造成的。
圖4 綠豆皮的紅外光譜圖
2.3.3 XRD射線衍射表征結(jié)構(gòu)及分析
通過(guò)對(duì)綠豆皮粉的X射線衍射譜圖的分析,GY與GH出峰位置基本相同(圖5),均在掃描角度為22.62°處出現(xiàn)主衍射峰,15.00°和34.66°出現(xiàn)次衍射峰,呈現(xiàn)出典型的纖維素Ⅰ型晶體結(jié)構(gòu)[28]。但GH峰值明顯低于GY,說(shuō)明黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后的綠豆皮結(jié)晶區(qū)所占面積有明顯下降。這可能是固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中部分結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)被破壞,向非定性區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,相對(duì)結(jié)晶度下降,導(dǎo)致綠豆皮膳食纖維聚合度降低,這與劉鴻鋮等[29]的研究結(jié)果是相似的。
圖5 綠豆皮的X射線衍射圖
2.3.4 綠豆皮主要組成變化分析
根據(jù)圖6的觀察結(jié)果可知,在降解的初期階段,綠豆皮中的木質(zhì)素和半纖維素的降解速度高于纖維素,在中期階段纖維素的降解速度開始提升,半纖維素的降解速度也隨之提高。說(shuō)明黑曲霉對(duì)綠豆皮成分的降解過(guò)程中,先降解包裹在纖維素上的木質(zhì)素和半纖維素,隨著酶的進(jìn)一步作用,纖維素才開始降解,而纖維素的降解又會(huì)促進(jìn)附著在其表面的半纖維素的降解。黑曲霉對(duì)綠豆皮中纖維素的降解率最高,達(dá)到57.71%;其次是半纖維素,降解率為46.00%;最低的是木質(zhì)素,降解率為43.27%。而李紅亞等[30]對(duì)玉米秸稈進(jìn)行降解,纖維素和半纖維素的降解率僅為30.5%和41.4%。這表明黑曲霉對(duì)綠豆皮有較好的降解能力,特別是對(duì)綠豆皮中含量最高的纖維素具有有效降解作用。
圖6 纖維素、半纖維素及木質(zhì)素降解率變化
研究黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對(duì)綠豆皮特性的影響,并進(jìn)行了降解機(jī)理的探究。結(jié)果表明,在制粉特性上,經(jīng)過(guò)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后綠豆皮的粒徑明顯下降8.53倍、比表面積顯著上升32.46倍,這將有利于綠豆皮粉的加工與利用。在理化特性上,經(jīng)過(guò)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后綠豆皮的持水力、溶解性、膨脹力、持油力、陽(yáng)離子交換能力、膽酸鈉吸附能力及葡萄糖吸附能力等均得到明顯提升。在降解機(jī)理上,主要通過(guò)電鏡掃描、紅外掃描及XRD晶體衍射進(jìn)行探究。黑曲霉對(duì)綠豆皮的降解,先降解木質(zhì)素與半纖維素,再降解纖維素。主要通過(guò)破壞纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的化學(xué)鍵,使長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)被降解為短鏈結(jié)構(gòu),破壞結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu),降低相對(duì)結(jié)晶度,并轉(zhuǎn)化纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等主要成分,進(jìn)而破壞綠豆皮結(jié)構(gòu),使其變得疏松多孔,讓綠豆皮更易被粉碎為粒徑更小、比表面積更大的粉體,具有更好的物質(zhì)交換效率,提升綠豆皮的理化特性。
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