董澤鵬，胡世博，楊魁，趙偉，劉暢，鄭見寶
（西安交通大學第一附屬醫院普通外科，陜西 西安 710061）
直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，約占結直腸癌的30%，且臨床預后較差［1］。近年來男性和女性的直腸癌發病率分別從7.68∕10萬和6.51∕10萬上升至11.45∕10萬和8.28∕10萬［2］。失巢凋亡是指細胞失去正常的細胞凋亡過程，導致異常增殖和生存，從而促進腫瘤的形成和發展［3］。癌細胞的遠處轉移通常伴有細胞失巢凋亡功能的失調［4］。一些報告已經證實，失巢凋亡在腫瘤轉移和癌癥進展中起著重要作用，包括胃癌［5］、肺癌［6］、食管癌［7］和子宮內膜癌［8］。本研究通過生物信息學方法篩選與直腸癌患者預后相關的失巢凋亡基因，并構建臨床預后預測模型，為直腸癌的診斷和預后預測提供參考。
1.1 數據采集
從TCGA數據庫下載直腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織的mRNA高通量測序數據和臨床資料。對基因表達數據進行歸一化處理，并Log2轉化后用于后續分析。排除了臨床信息缺失或患者生存時間為0的樣本。從GeneCards（https：∕∕www.genecards.org∕）中提取338個相關性評分>1失巢凋亡相關基因。
1.2 方法
1.2.1 預后模型的構建 通過單變量Cox回歸方法獲得候選的失巢凋亡預后基因。為了達到最大化減小過度擬合風險的目的，采用 LASSO算法再次篩選基因?；貧w分析中的獨立變量為基因的表達量，響應變量是 TCGA 隊列中患者的生存時間和生存狀態。使用以下公式計算每個樣本的風險評分：風險評分=（ ARG1×系數）+（ARG2×系數）+…+（ARGn×系數）。根據預后模型得到的風險評分求其中位數，將納入的直腸癌患者劃分為高、低風險組。
1.2.2 預后模型的評價 使用“survival”包對風險評分進行獨立的預后分析并繪制ROC曲線。對兩組采用 Kaplan-Meier方法繪制生存曲線。應用“time ROC”包構建預后模型的時間依賴ROC曲線。分別對年齡、性別、Stage分期和風險評分做單因素和多因素的獨立預后分析，繪制森林圖進行可視化。
1.2.3 功能富集分析 從STRING（https：∕∕cn.string-db.org∕）獲得與預后基因相關的50個基因，通過R語言“clusterprofiler”包對50個基因進行基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）分析。
1.3 統計學方法
采用 Wilcoxon 檢驗和t檢驗比較不同組間數據。P-Value 均為雙側檢驗，以P<0.05 為差異具有統計學意義。所有的統計學分析都在R4.1.2上運行。
2.1 確定與失巢凋亡相關的預后基因
采用單變量Cox方法在338個失巢凋亡相關基因中獲得15個有代表性的預后基因（P<0.05），并繪制森林圖（圖1A）。大部分預后相關基因（9∕15）在預后不同患者組織間存在差異表達（圖1B）。隨后，本研究進行了LASSO回歸，以消除過度擬合的基因（圖1C-D）。最終得到確定預后模型的6個基因：CSNK2A1、INHBB、PAK1、CD63、CTNNB1、CLU。相對應的風險評分=（CSNK2A1×（-0.165 2））+（INHBB×（0.150 1））+（PAK1×（-0.005 4））+（CD63×（0.858 7））+（CTNNB1×（-0.058 8））+（CLU×（0.184 4））。隨后，利用風險評分的中值將樣本分成高風險評分組和低風險評分組。
圖1 與失巢凋亡相關的預后基因
2.2 預后模型的評價
使用ROC來判斷預后模型的準確性和特異性，得到預后模型的AUC值為0.810（圖2A）。通過箱線圖發現風險評分在死亡和生存樣本之間存在明顯差異（P<0.05），即生存樣本的風險評分較死亡樣本風險評分低（圖2B）。K-M分析顯示風險評分高組的臨床結果不佳（圖2C）。預后模型判斷1年、3年和5年直腸癌生存率的AUC值分別為0.84、0.86和0.92（圖2D）。
圖2 預后模型的評價
通過單因素分析（表1），根據預后模型得到的直腸癌風險評分可以作為獨立的預后因素（P<0.05）；
為了進一步探究風險評分的準確性，使用多因素COX分析（表2），結果顯示，在排除年齡和TNM分期等混雜因素后，風險評分仍可以作為獨立的直腸癌預后因素（P<0.05）。
表1 風險評分單因素分析
表2 風險評分多因素分析
2.3 功能分析
從STRING上獲取到50個與預后基因相關的基因，并得到基因之間的關系圖（圖3A）。
圖3 失巢凋亡相關基因互作與富集分析
KEGG分析（圖3B）中，基因集富集在黏附連接、Wnt信號通路、子宮內膜癌、胃癌、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等疾病中。
GO分析（圖4A-C）中，在分子功能（MF）層面，基因集富集在鈣黏蛋白結合、DNA-結合轉錄因子結合、泛素蛋白結合；
在細胞定位（CC）層面，基因集富集在轉錄調節復合體、細胞連接、質膜外在成分、黏附連接、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合體；
在生物學過程層面（BP），基因集富集在Wnt信號通路的調節、調節細胞連接、對類固醇激素刺激的反應。
圖4 失巢凋亡相關基因本體論分析
直腸癌是危害人類健康的惡性腫瘤之一，近年來中國新增結直腸癌患者約37.6萬例，結直腸癌死亡患者約19.1萬例，呈現明顯的增長趨勢［9］。因此，迫切需要明確可靠的預后指標，以增強直腸癌患者預后的預測。隨著生物信息學的進步，可以對高通量測序數據進行深度分析，挖掘出與直腸癌預后相關的關鍵基因［10］。本研究建立了針對直腸癌患者的預后預測模型，該模型根據失巢凋亡相關基因特征預測直腸癌患者的預后情況，并通過K-M曲線、ROC曲線、時間依賴ROC等方法驗證模型的準確性和特異性。通過單因素和多因素的聯合分析，證實預后模型可以穩定地預測患者的生存情況。
首先在TCGA-READ數據的基礎上，通過單因素回歸分析尋找到15個與直腸癌預后相關的失巢凋亡基因。隨后使用LASSO回歸分析，建立了由6個失巢凋亡基因構成的預后預測模型，這些基因包括CSNK2A1、INHBB、PAK1、CD63、CTNNB1和CLU。
CSNK2A1作為絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶，可以磷酸化酸性蛋白質，從而調控細胞周期、細胞凋亡等生物學過程［11］。CSNK2A1可能通過NF-κB信號轉導通路逆轉miR-1184的高表達，從而抑制結腸癌細胞增殖，增強結腸癌細胞凋亡［12-13］。INHBB作為一種新型預后生物標志物，其在結直腸癌組織中的高表達表明預后不良［14］。此外，INHBB的高表達與直腸癌浸潤深度、遠處轉移呈顯著正相關［15］。與INHBB類似，CD63的高表達可能會通過上皮-間質轉化通路影響直腸癌患者的預后［16］。PAK1作為將Rho-GTP酶與細胞骨架重組和核信號轉導聯系起來的關鍵因子，可能通過激活應激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase， SAPK）和負調控10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）誘導結直腸癌的發生發展［17］。CTNNB1作為編碼β-連環蛋白的基因，通過Wnt通路促進惡性上皮細胞從細胞外基質分離后的存活，并使這些細胞以非依賴錨定性方式生長［18］。CLU是一種具有廣泛功能的多效性蛋白質，在眾多途徑中起著多效性作用，包括參與細胞衰老和致癌信號轉導，其高表達水平提示結直腸癌患者的不良預后［19］。
這些基因在一定程度上影響結直腸癌的進展，但其中的大部分基因的研究都是基于結直腸癌患者的共同樣本，并未將結腸癌和直腸癌分開具體討論［20］。
在功能分析中，基因集富集在鈣黏蛋白、細胞連接、質膜外在成分等與失巢凋亡相關的功能；
KEGG分析也同樣支持本研究所建立的模型與Wnt通路、結直腸癌之間存在明顯的聯系。由此可推斷，失巢凋亡與直腸癌的發生進展之間存在密切關聯。
綜上所述，本研究經過多種生物學方法，構建了6個與失巢凋亡相關基因的預后模型，可能為直腸癌患者的個體化治療和評估提供參考。
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