【中圖分類號】R68 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）03-0-01
缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD），即冠狀動脈粥樣硬化性心臟（coronary atherosclerotic heart disease ），指冠狀動脈粥樣硬化或（和）冠狀動脈功能性改變使血管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。隨著經皮冠狀動脈介入治療（Percutaneous coronary intervention ，PCI）和冠狀動脈搭橋術（CABG）廣泛應用于臨床，IHD治療效果明顯，但對于嚴重的IHD，如彌散性病變及梗死區遠端心肌壞死、血管阻塞等，通過現有治療手段患者即使可以渡過急性期，因心肌再生能力不足，壞死心肌纖維化、瘢痕化仍不可逆轉，導致心力衰竭等嚴重并發癥的發生。近年，干細胞移植研究給心血管疾病帶來了新的曙光。其中，骨髓間充質干細胞（陳雨bonemarrow mesenchymal stem cells， BMSCs ）由于其來源廣泛、容易獲取、擴增能力強、多項分化潛能、易與宿主細胞建立聯系及免疫原性低、能歸巢、無醫學倫理學爭議等[1]優越性被大量前臨床研究用于缺血性心臟病的細胞治療。
1.骨髓間充質干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）的概述：
血BMSCs屬于骨髓干細胞中的一種，具有高度自我更新能力和多向分化能力的成體干細胞群體，最早于1987年，Friendenstein等[2]發現在塑料培養皿中培養的貼壁的骨髓單個核細胞在一定條件下可分化成為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞，而且這些細胞經過20～30個培養周期后仍能保持其多向分化潛能；研究顯示，人BMSCs在體外用5-氮胞苷（5-aza）處理24小時后可誘導成心肌細胞[3]Wang等人觀察到在“環境誘導分化“的作用下，不經5-aza處理的BMSCs在體內可分化為心肌細胞并與宿主心肌細胞之間形成閏盤聯系[4]。該類骨髓間充質干細胞不表達造血細胞系標記CD14、CD34、CD45及CD133，不表達內皮細胞系標記如vonWillebrand因子、P選擇蛋白，而表達CD105、CD90及CD166抗原。后來的研究發現在體外培養條件下，BMSCs還具有向其他胚層細胞方向分化的能力，如肌腱、脂肪、肌肉、內皮、神經及心肌細胞等[5][6]。
2.取材：
不同組織來源的間充質干細胞的表型、增值分化能力和基因表達有一定差異，骨髓間充質干細胞占有核細胞總數的0.001%—0.010%，并隨著年齡的增大而減少[7]，為實驗研究的方便性和可行性，宜取幼齡小型哺乳動物的長骨骨髓。
3.分離純化及鑒定
目前對于骨髓間充質干細胞的分離純化常用的方法有：貼壁細胞離心法、密度梯度離心法、流式細胞儀法與免疫磁珠分離法等。貼壁細胞分離法是根據骨髓間充質干細胞貼壁生長的特性，通過反復換液去除懸浮細胞，使其與造血干細胞分離。培養所得的原代骨髓間充質干細胞貼壁增殖快，細胞活性高，缺點是所得細胞成分復雜，分離難度高。密度梯度離心法是根據骨髓間充質干細胞與其他細胞的密度差異進行細胞分離。這種方法與貼壁分離法結合，分離得到的細胞純度相對更高，獲得廣泛采用。免疫磁珠分離法是利用的表面特異性抗原，利用免疫磁珠進行分離，它是目前所能獲得BMSCs純度最高的方法。[8]但由于BMSCs表面缺乏特異性標志，及分選后的細胞出現了增殖緩慢等問題，而且費用昂貴、操縱復雜、目前應用較少[9]。由于間充質干細胞表面具有多種標記物，但目前尚未篩選到獨有的標志分子，給間充質干細胞的鑒定帶來可一定的困難，2006年，國際細胞治療協會提出了關于間充質干細胞鑒定的最低標準，包括3方面內容：在標準培養條件下能貼塑料瓶壁生長。95%以上的細胞表達CD105、CD73、CD90，同時95%以上的細胞不表達CD45、CD14或CD11b、CD79a或HLA-DR。能分化為骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞。
4.預處理：
4.1 低氧處理：間充質干細胞在培養基中一般呈單細胞層生長，在低氧條件下，其增擴率可增加30倍。低氧條件下預處理BMSCs能增強BMSCs對心肌細胞凋亡的保護作用。
4.2 基因轉染MSCs：目前認為血管內皮生長因子（VEGF）是最有效刺激血管生成的細胞因子之一，人類至少有4種VEGF，分別由121、165、189和206個氨基酸組成，其中VEGF165是發揮生物學效應的主要成分。Carmeliet等人發現VEGF表達水平對獲得性血管生成是非常重要的。VEGF基因轉染的MSCs能分泌較高水平的VEGF。研究顯VEGF基因轉染的MSCs移植在1個月后能產生較強的成血管反應，導致血管密度顯著增加，且絕大多數新生血管是宿主源性的。
由于新生血管受多種生長因子的調控，單一生長因子生成的血管存在不穩定和易滲漏問題，聯合基因治療是非常重要的。缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）是細胞在缺氧條件下產生的具有轉錄活性的蛋白，不僅可以結合多種促血管因子如血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子β（TGF-β）等及其受體基因啟動子上的缺氧反應元件，從而增強相應蛋白表達，啟動血管新生的過程，提高血流灌注。
4.3 胰島素樣生長因子（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）具有誘導細胞增殖、移植細胞凋亡、緩解心力衰竭過程中心肌細胞外基質重構作用的一類生長激素。研究顯示IGF-1預處理的MSCs對心肌梗死后心肌有顯著的抗炎作用，并且IGF-1預處理通過增強MSCs歸巢效率及抗炎作用進一步提高心肌再生能力。
4.4 信號通路：MSCs中存在分化為各種功能細胞的目的基因，在分化的不同階段，會有不同的基因表達，這種事件是隨機的受微環境、細胞因子及信號通路的影響。如果加入誘導因子或細胞及信號通路調節子，增強目的基因表達，抑制其他基因的表達，就可使干細胞向目的細胞分化。目前有學者研究表明Notch信號通路對于干細胞分化為心肌細胞起著重要的調節作用。
5.移植途徑的選擇：
（1）經外周靜脈注射：操作簡單，與干細胞歸巢有關，但也存在以下缺點細胞在血中循環時間較其他方法長，存在滯留現象，丟失的數量也較多；對其它臟器有影響，在肺、肝、脾中發現標記的干細胞；歸巢有賴于趨化因子的濃度梯度，如心肌梗死時間過久，歸巢的效果會受到影響；④異種的細胞移植不能用此種方式。（2）經冠狀動脈注入：經心導管將MSCs選擇性的直接注入缺血損傷區域的冠狀動脈，MSCs易于進入損傷心肌內，為干細胞歸巢提供了有利條件，但晚期缺血性心臟病患者冠狀動脈增厚，MSCs無法通過細胞壁，移植效果欠佳，且目前可行性差。（3）骨髓動員：并不對干細胞進行分離、培養及灌注，而是應用粒細胞集落刺激因子、干細胞因子靜脈注射使來自骨骼的干細胞、祖細胞進入血液，方法簡單，但動員的細胞并非BMSCs一種，實驗中也難以確定細胞進入血液的細胞的量（4）心肌內注射：心肌內注射分為心外膜注射和經心內膜注射。心內膜注射法定位雖然更加準確，但對技術水平和設備要求高，目前臨床廣泛開展困難；開胸在直視下對梗死區域心肌進行MSCs移植的心外膜法，定位性好，Zhang等報道該途徑可使MSCs準確移植于梗死區及周邊區，最大限度的達到細胞移植的效果，改善移植后患者心功能的恢復。
6.6 骨髓間充質干細胞治療缺血性心臟病的機制：（1）分化為心肌：骨髓間充質干細胞多通過磷脂酰肌醇-3激酶（PI3-K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶途徑參與心肌細胞分化。PI3-K是一種與細胞信號轉導有關的胞內蛋白激酶，可被多種細胞因子激活。目前研究最多的細胞因子是轉化生長因子-β（TGF-β）和骨形態發生蛋白2（BMP-2）。（2）促進血管新生，改善心肌血液供應：BMSC已經被證實可以分化為血管內皮細胞、平滑肌細胞等血管結構細胞，這些細胞參與血管發生、發育及生成。[21]（3）旁分泌機制：旁分泌機制依賴于骨髓間充質干細胞各種因子的釋放，包括血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子和基質細胞源性生長因子，通過組織間隙作用于周圍細胞，發揮其血管再生、抗凋亡、促進有絲分裂和免疫調節等生理作用。（4）歸巢理論：BMSCs在多種因素的作用下可定向趨向性遷移越過血管內皮細胞至靶向組織并定值存活。[22]（5）信號通路：MSCS在特定環境下可分化為多種組織細胞，通過精確調控其信號通路，可誘導其向特定的細胞分化。MSCS在增殖及分化過程中存在Notch信號通路，在干細胞分化為心肌細胞的過程中Notch信號上調。7.實驗結果評價指標的選擇：（1）心肌酶學（2）心臟彩超（3）病理（4）通過微積分等方法計算壞死心肌面積（5）冠狀動脈造影（6）核素心肌顯像（7）免疫熒光標志物示蹤法
8.討論：
（1）移植時間、移植途徑、移植細胞量的選擇。（2）是否對骨髓間充質干細胞進行預處理。（3）移植后處理：如服用他汀類調脂藥物可抑制骨髓間充質干細胞向成脂細胞分化。
參考文獻：
[1]Mohammad Nurulqadr Jameel and Jianyi zhang.Stem Cell Therapy for Ischemic Heart Disease.Antioxid.Redox Signal.2010；13（12）：1879-97
[2]Friedenstein AJ，Petrakoua KU，Kurolesoua AI.Heterotopic trans plants of
bone marrow.Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.J Transp Latation .1896；6（2）：230-247
[3]Antonitisis P，Kaidoglou A，Papakontantinou C.In vitro cardiomyogenic
Differfentitation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells.The role of 5-azacytidine .Interact Cardiovasc Thorac Surg.2007 Oct；6（5）；593-7
[4]Wang J S，Shun D，Gapipeau J，et al.Marrow stromal cells for cellular cadiomyoplasty；feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg.2000 Nov；120（5）；999-1005
[5]丁志，楊松林.間充質干細胞生物學特性及其分化潛能[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（1）：147-150
[6]蔡清明，周天玖.骨髓間充質干細胞治療心肌梗死的可能機制研究.中外醫療，2011.03
[7]周美玲，王愛玲，徐鳳，陳鋒.低氧增強骨髓間充質干細胞對缺氧誘導心肌細胞凋亡的可能性.中國組織工程研究與臨床康復.2011.15（6）
[8]于勤，朱寧，李倩曉，李曉菲，那榮妹，鄭曉群，方唯一.人血管內皮生長因子165基因聯合間充質干細胞治療對擴張型心肌病膠原重塑的影響.中國臨床醫學.2011，18（5）
[9]血管內皮生長因子基因轉染骨髓間充質干細胞治療缺血性心臟病的研究.中國學位論文全文數據庫