許文琳 姜 碩 譚曉嬋 孫丹紅 潘旭初 王 紅 王 聰
失眠屬睡眠障礙范疇，發病率逐年上升，我國成年人失眠發病率約為19.6%[1]。長期失眠會導致代謝性疾病的發生，如肥胖癥、血脂異常、2 型糖尿病、高血壓等[2]。研究發現，青少年總睡眠時間減少與超重或肥胖具有顯著相關性[3]。研究顯示，睡眠不足可導致包括胰島素敏感性降低、葡萄糖耐量降低、夜間皮質醇濃度升高、胃生長激素釋放激素升高、瘦素水平降低在內的眾多內分泌失調性疾病[4]。肝臟主要參與脂肪、糖、蛋白質等物質代謝，對維持機體代謝至關重要。研究發現，睡眠剝奪（sleep deprivation）可上調肝臟脂肪生成酶從而誘導脂肪變性和胰島素抵抗[5]。睡眠剝奪可引起模型小鼠肝臟中谷胱甘肽代謝、果糖和甘露糖以及丙酮酸代謝紊亂[6]。但睡眠對肝臟代謝影響的核心基因及關鍵通路仍未知曉。本研究基于基因表達綜合數據庫（gene expre-ssion omnibus，GEO），對睡眠剝奪條件下模型小鼠肝臟組織進行基因及通路篩選，探討失眠對肝臟代謝影響的生物學機制，報道如下。
1.1 基因芯片數據的獲取 本研究以GEO 數據庫為數據源，設定“sleep deprivation”為搜索詞，獲取GSE92913 數據集，該數據集基于GPL16570 平臺（Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST Array）。將原始資料分為睡眠剝奪組及對照組，利用高通量測序檢測兩組小鼠肝臟中的基因表達水平。
1.2 差異基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選 下載GSE92913 數據集，使用R 語言對芯片原始數據進行探針轉化，剔除無對應基因及重復探針數據。采用GEO 數據庫自帶的在線分析工具GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）進 行DEGs 分析，設置篩選條件為：調整P 值（adj.P）＜0.05且|log2FC|≥1（FC 為fold change，差異倍數）。
1.3 DEGs 的功能富集分析 DAVID 平臺數據庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）提供大量基因、蛋白的生物功能信息，是進行功能富集分析的常用數據庫。將DEGs 上傳到DAVID 平臺，設置物種為“Mus musculus（小鼠）”，選擇生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF） 進 行 基 因 本 體（gene ontology，GO）富集分析；
選擇Pathways 進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。設置設定篩選標準為P＜0.05，使用R 語言（ggplot2 包）將結果進行可視化。
1.4 蛋白互作網絡（protein-protein Interaction，PPI）和樞紐基因的構建 將DEGs 上傳至STRING 平臺（https://www.string-db.org/），設置生物種類“Mus musculus”，最小相互作用閾值設定成“最高置信度（highest confidence）”為0.4，構建PPI，預測差異表達基因編碼的蛋白質之間的相互作用。導出TSV 格式資料，將其導入Cytoscape3.8.2 軟件中，運用cytohubba插件進一步分析，采用degree 算法選擇出排名前10的樞紐基因。
2.1 睡眠剝奪組與對照組DEGs 的篩選 GSE92913數據集共包含睡眠剝奪組樣本7 個和正常對照組樣本7 個，正常對照組樣品編號分別為GSM2440309、GSM2440312、GSM2440313、GSM2440314、GSM24403 16、GSM2440317、GSM2440319，睡眠剝奪組樣品編號分別為GSM2440306、GSM2440307、GSM2440308、GSM2440310、GSM2440311、GSM2440315、GSM24403 18。根據上述條件進行篩選，共有54 個DEGs 發生變化，基因上調的有34 個，下調的有20 個，見圖1。利用R 語言（pheatmap 包）對54 個DEGs 進行層次聚類分析，并繪制基因熱圖，見圖2。
圖1 睡眠剝奪小鼠肝臟差異基因火山圖
圖2 睡眠剝奪小鼠肝臟差異基因熱圖
2.2 DEGs 的GO 功能和KEGG 代謝通路富集分析將54 個DEGs 導入DAVID 數據庫進行分析，共得到54 條GO 條目，按照P＜0.05 的顯著性富集篩選標準，得到36 條顯著意義的條目，其中21 條（58.33%）聚集在BP，包括脂質代謝、類固醇代謝、三酰甘油合成正調節、晝夜節律、膽固醇調節元件結合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）信號通路等眾多生物學過程；
共有6 條（16.67%）聚集在CC，包括細胞內膜結合的細胞器、內質網膜、內質網、高爾基體等多種復雜細胞組分；
9 條（25.0%）聚集在MF，包括氧化還原酶活性、血紅素結合、鐵離子結合、跨膜信號受體活性等，見表1。KEGG 信號通路富集分析發現，差異基因參與氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）信號通路、類固醇激素生物合成、癌癥中的轉錄失調、視黃醇新陳代謝4 條信號通路，見表2。
表1 睡眠剝奪小鼠肝臟DEGs 的GO 富集分析
表2 睡眠剝奪小鼠肝臟DEGs 的KEGG 富集分析
2.3 蛋白互作網絡和樞紐基因篩選結果 將DEGs上傳至STRING 平臺構建PPI 網絡，通過Cytoscape3.8.2 進行網絡可視化，運用cytohubba 插件進一步分析，cytohubba 算法顯示PPARγ、甾醇調節元件結合轉錄因子1（sterol regulatory bind factors1，SREBF1）、成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factors21，FGF21）、花生四烯酸細胞色素P450ω 羥化酶（arachidonic acid cytochrome P450 ω hydroxylase14，Cyp4a14）、細胞死亡誘導DFFA 樣效應蛋白C（cell death induced DFFA-like effector protein C，Cidec）、芳基烴受體核轉位因子樣蛋白1（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocation factor -like protein 1，Arntl）、磷脂酸磷脂酶1（phosphatidic acid phospholipase 1，Lpin1）、細 胞 色 素 酶2b10（cytochrome，Cyp2b10）、胰島素誘導基因2（insulin induced genes 2，Insig2）、脂滴包被蛋白5（perilipin5，Plin5）為睡眠剝奪所涉及的關鍵基因，見圖3。
圖3 睡眠剝奪小鼠肝臟差異基因蛋白互作網絡圖
失眠為臨床常見病、多發病，我國失眠患病率遠高于世界水平并呈現逐年增長的趨勢[7]。失眠與代謝關系密切，而肝臟主要參與糖、脂肪、蛋白質等物質代謝過程，因此睡眠與肝臟功能密不可分。本研究基于GEO 數據庫通過對微陣列數據進行生物信息學分析，識別出睡眠剝奪組和正常睡眠組之間的差異基因，并通過進行GO、KEGG 富集分析、PPI 和樞紐基因篩選，揭示DEGs 的功能，以探究失眠的發病機制與肝臟代謝的關系。
運用KEGG 通路分析得出影響失眠發病的信號通路為PPAR 信號通路。PPAR 信號通路屬于核受體超家族，在抑制神經炎癥、延緩神經退行性變、抗氧化過程中均發揮著重要作用[8-9]。有研究[10]表明，通過激活PPAR 信號通路可極化M2 型小膠質細胞，改善中樞神經功能。有研究[11]顯示，中藥天王補心丹的有效成分可通過特定位點與PPAR 信號通路中特定的蛋白靶點結合，進而通過調節機體內能量代謝而發揮睡眠調節作用。此外，本研究發現類固醇激素生物合成通路、癌癥轉錄失調通路和視黃醇新陳代謝通路也參與了睡眠剝奪下的肝臟代謝途徑，這些通路均與肝臟物質代謝有關。
本研究中PPI 和樞紐基因篩選結果提示，PPARγ為睡眠剝奪過程中參與肝臟代謝的關鍵基因。PPARγ功能主要涉及誘導脂肪細胞分化、維持脂代謝穩態[12]。此外PPARγ 還具有維持糖代謝平衡的功能，進而能夠改善胰島素抵抗狀態，PPARγ 通過直接調控攜帶有PPREs 的糖代謝相關基因的表達，上調脂肪細胞分泌因子，下調腫瘤壞死因子α（TNF-α）和Resistin 等的表達來提高胰島素敏感性。PPARγ 還可以通過促進肌肉中葡萄糖的利用，并減少肝臟中葡萄糖的生成達到控制糖代謝的作用[13]。PPARγ 亦有神經保護功能，有研究顯示可通過促進PPARγ 的核轉位并激活PPARγ來緩解神經損害[14]。PPARγ 也能夠調節睡眠-覺醒過程，在嚙齒類動物下丘腦注射PPARγ 激動劑可減少慢波睡眠并提高覺醒量，而PPARγ 拮抗劑則產生相反效果，在小鼠模型中也可以觀察到類似結果[15]。可見PPARγ 為影響睡眠與肝臟代謝的關鍵基因。
SREBF1 基因也是睡眠剝奪過程中肝臟代謝所涉及的關鍵基因。SREB1 屬于固醇調節元件結合蛋白SREBPs 的主要編碼基因，可以啟動脂質生物合成和攝取，并且在肝臟脂質合成中起作用，其表達失常與胰島素抵抗、肥胖癥、糖尿病、脂肪肝等肝臟代謝性疾病關系密切[16-17]。在限制飲食所造成的睡眠-覺醒晝夜節律紊亂動物模型中發現，由SREBF1 基因調控的SREBPs蛋白表達失常會造成睡眠-覺醒晝夜節律紊亂[18]。基于人體的研究發現，在睡眠剝奪受試者中SREBF1 基因表達水平明顯下降，而這種下降程度與睡眠剝奪敏感程度相關[19]。在睡眠剝奪人群中，SREBF1 基因表達的晝夜節律性明顯失調[20]。這些結果均提示SREBF1 基因為連接睡眠與肝臟代謝的重要基因。
FGF21 是肝細胞分泌的細胞因子，可以作為機體內代謝調節劑，對機體內脂質和葡萄糖內穩態具有多效調節作用[21]。FGF21 可通過誘導產生抗應激劑或酮體來影響睡眠-覺醒，導致機體對社會壓力的恢復[22]。臨床研究顯示，健康成年人急性睡眠不足導致FGF21 節律性水平升高[23]。LPIN1 也是睡眠剝奪所涉及的關鍵基因，在脂質合成中起關鍵作用，同時作為轉錄輔助活化因子對脂質代謝過程起效[24]。部分LPIN1 突變患者表現為脂代謝紊亂、體脂含量異常，在脂肪組織和骨骼肌組織中表現尤為明顯[25]。在一項機制研究[26]中發現，睡眠剝奪引起的肝臟脂肪變性和肝臟胰島素抵抗是通過上調LPIN1 等脂肪生成酶介導的，足見其與失眠關系緊密。此外，Cyp4a14、Cidec、Arntl、Cyp2b10、Insig2、Plin5 基因也是睡眠剝奪影響肝臟代謝的關鍵基因。
因此，睡眠剝奪影響機體肝臟代謝的諸多過程，涉及眾多信號通路，此過程可能與神經炎癥、抗氧化、癌癥轉錄失調、視黃醇新陳代新等生物途徑密切相關。此外，本研究通過分析預測了睡眠剝奪相關疾病影響代謝的可能機制并篩選出參與其中的核心基因，提示PPARγ、SREBF1、FGF21、Insig2、Plin5 等基因表達失調與此過程緊密相關，這可能為治療睡眠類和代謝失調性疾病提供分子靶標和診斷標志物，為失眠等睡眠障礙的基礎研究與臨床診治提供新的思路。本研究具有一定的局限性，本研究完全基于GEO 數據庫中的數據，篩選出的核心基因仍需后期進一步通過實驗驗證。
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