穆秀杰, 張林林, 韓 毅
(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)
干旱、重金屬、紫外線等不利因素會影響植物自身的生長、發(fā)育。為了適應(yīng)環(huán)境,植物演化出一套完整的氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)來維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境氧化還原的平衡。植物受到外界刺激時,會在體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxide species,ROS)分子,如過氧化氫、羥基自由基以及超氧陰離子等[1]。高水平的ROS對植物有毒害作用,ROS的清除分為酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)2種,得以維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平的穩(wěn)態(tài)[2-4]。酶促系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等;維生素C、還原型谷胱甘肽、類黃酮等[5]構(gòu)成非酶促系統(tǒng)。近期研究表明,ROS還可以作為信號分子[6],參與病原體防御、調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉及生長發(fā)育等過程。ROS產(chǎn)生后,其自身作為信號分子激發(fā)磷酸化級聯(lián)反應(yīng)、鈣信號及激素介導(dǎo)的信號通路,以此做出防御。因此,生物體內(nèi)的ROS在一個合適的水平才得以維持細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行。
擬南芥硫氧還蛋白(TRX-h)是一個由19個基因編碼的小分子蛋白,基因定位于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體等,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核中也存在TRX-h蛋白[7],但功能尚不清楚。TRX-h基因家族成員的表達(dá)水平及表達(dá)模式各不相同,表明各自具有特異的功能[8]。擬南芥TRX-h1至TRX-h5 mRNA 在地上器官(如幼葉、成熟葉、長角果、花芽、花)中豐度高,而莖中豐度低些。TRX-h2、TRX-h4和TRX-h5在根中表達(dá)量很低,TRX-h1和TRX-h3 mRNA在根中根本檢測不到。通常情況下,TRX-h蛋白以還原形式存在,并且具有清除ROS的功能[9-10]。有研究顯示,棉花硫氧還蛋白參與花期調(diào)控[11],在黃萎病菌入侵后,棉花體內(nèi)硫氧還蛋白豐度提高,這表明硫氧還蛋白參與了這一防御過程。此外,在煙草中過表達(dá)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶,體內(nèi)TRX-h基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng),進(jìn)而增強(qiáng)了對丁香假胞菌的耐受性[12]。
本研究從野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia(Col-0)中克隆了TRX-h5基因,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為探索該基因的蛋白功能提供了理論依據(jù)。同時將TRX-h5基因的第39位和第42位半胱氨酸位點(diǎn)突變(TRX-h5M),探究該位點(diǎn)對TRX-h5蛋白活性的影響,為研究TRXs蛋白參與調(diào)控的ROS信號通路提供新思路。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗材料
野生型擬南芥植株Col-0、EYFP-TRX-h5-C39S-C42S(TRX-h5M)重組載體、表達(dá)載體pET28a(+)、大腸桿菌DH5α克隆菌株、大腸桿菌BL21表達(dá)菌株均由本實(shí)驗室保存。
1.1.2 實(shí)驗試劑與儀器
反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP聚合物、高保真酶、限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ、HindⅢ)、T4DNA連接酶、咪唑(C3H4N2)、His標(biāo)簽鎳柱、質(zhì)粒提取試劑盒、切膠純化試劑盒、瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、卡納霉素(工作質(zhì)量濃度為50 μg/mL)。
本實(shí)驗所用主要儀器有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、凝膠成像儀分析系統(tǒng)、電泳儀、高溫高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、搖床、超聲波細(xì)胞破碎儀、真空泵、超低溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)震蕩器,紫外分光光度計、冷柜等。
1.2 方法
1.2.1 生物信息學(xué)分析
用ExPASy-ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對TRX-h5基因編碼的氨基酸進(jìn)行基本理化性質(zhì)的分析;采用ProtScale在線工具(https://web.expasy.org/protscale/)對TRX-h5蛋白進(jìn)行親/疏水性分析;采用PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)在線軟件分析TRX-h5蛋白的亞細(xì)胞定位;采用 NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線軟件對TRX-h5蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析;利用美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫BLUST工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析TRX-h5蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域;采用 NPS@: SOPMA secondary structure prediction 和SWISS-MODEL預(yù)測TRX-h5蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。
1.2.2 引物設(shè)計與合成
首先從tair網(wǎng)站獲取TRX-h5基因的編碼序列(coding sequence,CDS),再使用Primer5.0設(shè)計引物。上游引物(NdeⅠ-FP):5’-GGAATTCCATATGATGGCCGGTGAAGGAGAAG-3’(下劃線部分為NdeⅠ酶切位點(diǎn));下游引物XhoⅠ-RP:5’-CCGCTCGAGTCAAGCAGAAGCTACA AGACCACC-3’(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。
以EYFP-TRX-h5M重組載體為模板的上游引物(BamHⅠ-FP)為:AAAAGGATCCATG GCCGGTGAAGGAGAAG;下游引物(HindⅢ-RP)為:AAAAAAGCTTTCAAGCAGAAGCTA CAAGACCAC。
1.2.3 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄
采用Trizol法提取RNA,利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)獲得cDNA,反應(yīng)體系為:2 μL的 5×PrimeScriptRT Mix,2 μg的 Total RNA,RNase Free ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。反應(yīng)條件為:25 ℃,10 min;42 ℃,30 min;85 ℃,5 min;4 ℃,3 min。
1.2.4TRX-h5基因的擴(kuò)增和純化
以擬南芥cDNA為模板,擴(kuò)增TRX-h5基因的CDS序列;以EYFP-TRX-h5M重組載體為模板擴(kuò)增TRX-h5第39位和第42位點(diǎn)突變(C突變?yōu)镾)的序列。PCR(5 μL)反應(yīng)體系為:5.0 μL的10×buffer,4.0 μL 的dNTP,2.0 μL的FP,2.0 μL的RP,0.6 μL的高保真酶,2.0 μL的Template DNA,34.4 μL的ddH2O。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;然后進(jìn)行30個PCR循環(huán)(94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min);72 ℃延伸10 min。PCR程序結(jié)束后,瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶大小是否正確,通過切膠純化的方式回收目的基因。
1.2.5 重組載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
將TRX-h5的膠回收產(chǎn)物和PET28a(+)質(zhì)粒使用XhoⅠ/NdeⅠ雙酶切;TRX-h5M膠回收和PET28a(+)使用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切。酶切后膠回收目的基因及線性化載體。連接反應(yīng)16 ℃過夜。連接體系為:5×buffer和基因片段各2 μL,T4 DNA連接酶和ddH2O各1 μL,pET28a(+)線性化載體4 μL。
將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用卡納霉素瓊脂平板篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)。挑選陽性克隆進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,鑒定為陽性的重組質(zhì)粒,送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序,測序正確后,將重組載體命名為pET28a(+)TRX-h5、pET28a(+)TRX-h5M,將重組載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。
1.2.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
將轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21的陽性單菌落先小搖后大搖,在220 r/min、37 ℃的條件下?lián)u至A600為0.6,加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.2 mmol/L),22 ℃的條件下誘導(dǎo)16～24 h。
誘導(dǎo)后的菌液4 ℃,6 000 r/min離心20 min去上清。沉淀用solution1(0.3 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH值7.6)按照每升誘導(dǎo)液加入30 mL的比例重懸,破細(xì)胞30 min,再用高速離心機(jī)4 ℃,12 000 r/min離心30 min取上清置冰上備用。
分別用solution1、solution2(20 mmol/LTris-HCl,0.3 mol/L NaCl,50 mmol/L咪唑,pH值7.6)洗脫雜蛋白,然后用solution3(20 mmol/L Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,0.3 mol/L咪唑,pH值7.6)洗脫目的蛋白。并利用透析袋除去咪唑,將蛋白保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.7 目的蛋白質(zhì)量濃度和酶活的檢測
以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將目的蛋白稀釋合適的倍數(shù)后使用紫外分光光度計在595 nm波長下測吸光度值,計算蛋白質(zhì)量濃度。TRX-h酶活測定反應(yīng)體系包含100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 值7.0)、2 mmol/L EDTA和130 μmol/L牛胰島素(含或不含2 μmol/LTRX-h5)。通過添加0.33 mmol/L DTT啟動酶促反應(yīng)。在650 nm處監(jiān)測TRX-h5引起的濁度。
2.1 TRX-h5基因的基本理化性質(zhì)分析
TRX-h5基因編碼一條含118個氨基酸的肽鏈,分子式為C594H933N149O169S8,相對分子質(zhì)量為13 122.32,理論等電點(diǎn)為5.19,脂溶性指數(shù)為89.24。該蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)為26.74,屬于穩(wěn)定性蛋白(小于40為穩(wěn)定蛋白)。在氨基酸殘基的組成上,丙氨酸(Ala)和纈氨酸(Val)數(shù)目最多,各占11.9%。
使用NCBI Concserved Domain軟件對TRX-h5蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果如圖1a所示。由圖1a可知,該蛋白屬于TRX家族。采用ExPASy-ProtScale對親疏水性進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1b所示。由圖1b可知,TRX-h5蛋白為親水性蛋白。對TRX-h5蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析,結(jié)果如圖1c所示。由圖1c可知,該蛋白含有3個磷酸化位點(diǎn),分別是2個絲氨酸(Ser)、1個蘇氨酸(Thr)。
圖1 TRX-h5蛋白一級結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)分析
2.2 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
TRX-h5蛋白的二級結(jié)構(gòu)運(yùn)用SOPMA在線軟件進(jìn)行分析,如圖2a所示。
圖2 TRX-h5蛋白結(jié)構(gòu)分析
從圖2a可以看出,該蛋白的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(45.76%)、無規(guī)則卷曲(22.88%)、伸展鏈(19.49%)和β折疊(11.86%),α-螺旋和無規(guī)則卷曲為該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件。
運(yùn)用 SWISS-MODEL建模軟件對TRX-h5蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析,模型是以同源建模的方式模擬,是在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上盤繞、折疊產(chǎn)生的特定空間結(jié)構(gòu),如圖2b所示。
2.3 TRX-h5的PCR擴(kuò)增
以擬南芥野生型CDS為模板,以TRX-h5-F和TRX-h5為引物進(jìn)行擴(kuò)增,核酸瓊脂糖電泳檢測結(jié)果如圖3所示,擴(kuò)增產(chǎn)物有一條特異性條帶,與擬南芥TRX-h5基因的大小相符(TRX-h5大小為357 bp)。
圖3 PCR擴(kuò)增TRX-h5基因片段瓊脂糖電泳圖
2.4 PET28a(+)-TRX-h5載體的構(gòu)建
提取陽性菌落質(zhì)粒進(jìn)行測序,結(jié)果顯示質(zhì)粒中連接的目的基因與TRX-h5基因片段完全相符,未發(fā)生任何突變,將送去測序的菌落進(jìn)行擴(kuò)搖,提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21,挑取單克隆進(jìn)行菌落鑒定。
本文利用Primer 5軟件在PET28a(+)載體上設(shè)計引物pET28a(+)-F(TAGTTATTGCTCAGCGGTGG)和pET28a(+)-R(TCATGAGCGCTTGTTTCGGC),利用PCR擴(kuò)增,確認(rèn)TRX-h5基因片段與載體是否成功連接。條帶在250～500 bp中間的位置,與實(shí)際大小357 bp相符,選取含目的基因的單克隆作為誘導(dǎo)菌種,如圖4所示。
圖4 菌落pET28a(+)-TRX-h5/BL21 PCR電泳圖
2.5 TRX-h5蛋白的誘導(dǎo)及純化
在22 ℃條件下,終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)12～16 h,SDS-PAGE電泳檢測誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)情況。誘導(dǎo)表達(dá)后的BL21菌體通過超聲波細(xì)胞破碎儀得到表達(dá)后的蛋白,經(jīng)鎳柱后,帶有His標(biāo)簽的TRX-h5蛋白和TRX-h5M蛋白得以純化,如圖5所示。
圖5 蛋白SDS-PAGE電泳圖
圖5中:M代表Marker;泳道1代表誘導(dǎo)前蛋白表達(dá)情況;泳道2代表誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)情況;泳道3代表樣品洗脫液;泳道4和泳道5代表雜蛋白的洗脫;泳道6和泳道7代表目的蛋白的洗脫。
由圖5可知,在接近14 kDa(TRX-h5分子量為13.1 kDa,6個組氨酸分子量為0.9 kDa)處出現(xiàn)單一的條帶,符合TRX-h5蛋白分子量大小。
2.6 TRX-h5蛋白的質(zhì)量濃度及酶活檢測結(jié)果
以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖6所示。
圖6 TRX-h5、TRX-h5M蛋白的酶活測定
根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線算出表達(dá)的TRX-h5蛋白質(zhì)量濃度為0.4 μg/μL;TRX-h5M蛋白質(zhì)量濃度為0.5 μg/μL。TRX-h5蛋白的2個半胱氨酸位點(diǎn)突變后,酶活力顯著降低。
在生長發(fā)育過程中,脅迫因子會使植物體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失去平衡,造成氧化脅迫。植物會演化出多種調(diào)節(jié)途徑和調(diào)節(jié)方式來對體內(nèi)氧化還原狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié),以避免氧化性傷害的產(chǎn)生,其中主要的調(diào)節(jié)方式包括:活性氧的酶促清除和非酶促清除;與谷胱甘肽相關(guān)的氧化還原調(diào)節(jié)等方式。
擬南芥硫氧還蛋白是由118個氨基酸組成的小分子蛋白。對TRX-h5蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析,結(jié)果表明該蛋白含有3個磷酸化位點(diǎn),分別是2個絲氨酸(Ser)、1個蘇氨酸(Thr)。TRX-h5是否參與了擬南芥氧化平衡的調(diào)節(jié),這些磷酸化位點(diǎn)是否為TRX-h5蛋白的修飾位點(diǎn),需要進(jìn)一步探究。TRX-h5蛋白屬于穩(wěn)定性蛋白,其二級結(jié)構(gòu)元件包括α-螺旋(45.76%)、無規(guī)則卷曲(22.88%)、伸展鏈(19.49%)和β折疊(11.86%),α-螺旋和無規(guī)則卷曲為該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件。
運(yùn)用 SWISS-MODEL建模軟件對TRX-h5蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析,該蛋白有3個半胱氨酸位點(diǎn),其中第39位和第42位半胱氨酸裸露在蛋白質(zhì)表面,將這2個半胱氨酸位點(diǎn)突變后,運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)TRX-h5M蛋白和TRX-h5,并測定2個蛋白的酶活力,分析發(fā)現(xiàn)TRX-h5的第39位和第42位半胱氨酸位點(diǎn)決定了該蛋白的催化活性。這意味著第39位和第42位這2個位點(diǎn)的半胱氨酸可能是調(diào)節(jié)擬南芥TRX-h5蛋白活力的關(guān)鍵位點(diǎn)。
植物在受到氧化脅迫后,信號分子引發(fā)防御信號,硫氧還蛋白作為參與調(diào)節(jié)氧化還原平衡的關(guān)鍵蛋白,其第39位和第42位半胱氨酸可能是信號分子的作用位點(diǎn),從而促發(fā)下游防御信號。這種調(diào)節(jié)方式需要進(jìn)一步證明。
本文對TRX-h5蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的預(yù)測,對研究其功能提供了理論依據(jù)。同時建立了體外表達(dá)TRX-h5的方法,探究了其第39位和第42位半胱氨酸對TRX-h5酶活力的影響。為TRX-h5的功能調(diào)節(jié)機(jī)制及植物氧化還原系統(tǒng)的研究提供了新思路。
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