馮 康，楊園園，劉 瓊，程 嵐，郝浩浩，王平平，金維環，郭紅祥
（1.河南農業大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002；
2.河南省煙草公司 駐馬店市公司，河南 駐馬店 463000；
3.中國煙草總公司 陜西省公司，陜西 西安 710061）
隨著工業化的發展，重金屬鎘（Cd）造成的土壤污染問題越來越嚴重。研究表明，Cd 具有高聚集、難降解、毒性強等特性，對生物生長發育和食品安全均能造成威脅。植物中過量積累的Cd 會抑制種子發芽、葉綠素合成、植物生長等，對幼苗產生不利影響[1]。Cd 也很容易進入農作物的可食用部分，進而在人體中富集。進入人體的Cd 主要積累分布在肝臟、胰腺和骨骼中，引發腎衰竭、心血管和內分泌失調等疾病。另外，Cd 還可以破壞人體骨骼系統，引起骨骼疏松，嚴重威脅人體健康[2]。因此，將植物的Cd 含量降低到安全水平，減輕Cd 對人體健康的損害，是降低Cd污染危害切實可行的方法[3]。
植物主要利用鋅（Zn2+）、錳（Mn2+）和鐵（Fe2+）等離子的轉運體來實現對Cd的吸收和轉運。例如：水稻OsNramp5 是在根系中表達的膜定位Mn2+轉運體，研究數據顯示，水稻OsNramp5突變體植株中Cd總含量和籽粒中Cd 積累量均呈現大幅度降低的現象，表明其在Cd 吸收過程中發揮作用[4]。IRT1 為鐵的轉運載體，可以將重金屬Cd 運往植物莖部[5]。陽離子/鈣離子（Ca2+）交換器（Cation/Ca2+exchangers，CCX）屬于Ca2+/陽離子反轉運蛋白（Ca2+/cation antiporter，CaCA）超家族，能通過氫離子（H+）、鉀離子（K+）或鈉離子（Na+）等陽離子逆電化學梯度交換Ca2+[6]。CCX 廣泛存在于細菌、植物和動物中，不僅具有轉運離子的功能，而且在響應外界環境脅迫的過 程 中 起 著 重 要 作 用[7‐8]。AtCCX1、AtCCX3和AtCCX4是擬南芥中CCX 家族成員。AtCCX1在擬南芥葉片衰老過程中高度表達，基因敲除AtCCX1和AtCCX4能使葉片保持常綠，而過表達AtCCX1則加速葉片衰老[9]。Ca2+缺失的條件下，AtCCX1和AtCCX4突變體幼苗均表現出明顯的生長障礙，表明AtCCX1可能通過Ca2+信號來調節葉片的衰老[9]。AtCCX3和AtCCX4定位于液泡膜，顯示出H+依賴的K+、Mn2+和K+運輸調節能力[10]。在煙草中過表達AtCCX3后發現，轉基因煙草中積累了大量的陽離子[10]。在水稻基因組中，目前共發現4個CCX 成員，其中OsCCX2被證明能增強酵母和擬南芥的Cd 耐受性，進一步研究發現，OsCCX2能將Cd2+裝載到木質部中，通過介導Ca2+轉運途徑促進水稻籽粒中Cd元素的積累[11]。目前，煙草CCX 基因家族成員及其功能還未見報道。
煙草是一種重要的葉用經濟作物，同時也是Cd富集植物，吸收的Cd主要累積于煙葉中[12]。植煙土壤中過量的Cd不僅會抑制煙株生長發育、降低煙葉的產量和品質，煙葉中的Cd還會通過抽吸過程中產生的主流煙氣被人體所吸收，造成潛在危害。有文獻報道，水稻OsCCX2參與Cd的轉運[11]。因此，擬克隆煙草NtCCX2基因及其啟動子，研究該基因對Cd吸收、轉運與累積的影響，探討通過調節NtCCX2降低煙葉Cd含量的途徑，為優質煙葉生產提供理論依據，以期為基因編輯改良煙草品種找到新靶標。
1.1 試驗材料與試劑
1.1.1 試驗材料 野生型K326 土培煙草（Nicotiana tabacumL.）種植在河南農業大學溫室（東經113°79′，北緯34°79′），溫度26～28 ℃，相對濕度60%，光周期為16 h光照/8 h黑暗。
組織特異性表達試驗：野生型K326 土培煙草生長到幼苗期、旺長期和成熟期時，取根、莖、葉樣品，置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。
鎘脅迫試驗：在八葉一心時期，選取長勢大小一致的18 株野生型K326 土培煙草，平均分為3 組，用濃度為0、200、1 000 μmol/L 的氯化鎘溶液澆灌，每組處理澆灌400 mL，每隔1 d 澆1 次，處理7 d 后取葉和根，置于-80 ℃冰箱中保存，用于Cd 含量的測定和RNA的提取。
激素信號響應試驗：在六葉一心時期，選取長勢大小一致的25 株野生型K326 土培煙草，分別用脫落酸（ABA）、乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）處理，濃 度 均 為4 mmol/L[13‐15]，每 株 噴 灑20 mL，分 別 在ABA 和乙烯利處理后0、2、4、8、24 h 取煙草的葉和根，在MeJA 處理后0、4、8、24 h 取煙草的葉和根，置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。
干旱脅迫與鹽脅迫試驗：在煙草旺長期，選取長勢一致的9 株野生型K326 土培煙草，其中3 株正常澆水作為對照（CK），其余的分別進行200 mmol/L NaCl 和干旱7 d 脅迫處理[16]，觀察其表型變化，處理7 d后取葉和根置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。
降鎘試驗：大田試驗品種為中煙100，種植于駐馬店泌陽縣，設置4 個處理：CK、噴灑降鎘靈（佛山市鐵人環?？萍加邢薰荆?、噴灑富硒寶（四川愛隆植物營業科技有限公司）、噴灑微量元素肥（山東海岱綠洲生物工程有限公司）。分別在移栽后30、60 d 按照使用說明噴施降鎘靈、富硒寶、微量元素肥。噴施7 d 后取樣，置于-80 ℃保存，用于Cd 含量的測定和RNA的提取。
1.1.2 試劑 DNA凝膠回收試劑盒和KK快提RNA試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；
質粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；
限制性內切酶購于NEB 有限公司；
cDNA 合成試劑盒MonScriptTMRT ⅢSuper Mix with dsDNase（Two-Step）購自莫納生物科技有限公司；
大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α 購自上海昂羽生物技術有限公司。
1.2 方法
1.2.1 煙草DNA、總RNA 的提取及cDNA 的合成采用CTAB 法提取野生型K326 土培煙草葉片中的DNA。利用莊盟公司植物KK 快提試劑盒提取煙草根、莖、葉中的RNA，利用Nanodrop 儀器測RNA 濃度，經瓊脂糖電泳檢測RNA 降解和污染情況。用莫納生物試劑反轉錄得到cDNA，于-80 ℃冰箱中保存用于基因的克隆和熒光定量PCR。
1.2.2 煙草NtCCX2基因的克隆及測序 在NCBI網站查找煙草基因組中NtCCX2基因序列，利用NCBI 網站中的Primer-BLAST 設計引物CCX2-F/CCX2-R（表1）。提取野生型K326 土培煙草葉片中的RNA，反轉錄得到cDNA，進行PCR，擴增體系：2×TaqPlus Master MixⅡ25μL，上、下游引物和cDNA模板各1μL，以無菌水補足50μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；
95 ℃變性15 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸2.25 min，33 個循環；
72 ℃延伸8 min。利用莊盟公司的DNA 凝膠回收試劑盒對擴增的目的片段進行回收，回收產物送至尚亞生物技術有限公司進行測序。
表1 本研究所用引物信息Tab.1 Information of primers used in this study
1.2.3 煙草NtCCX2基因的生物信息學分析 利用DNAMAN 軟件將NtCCX2基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；
根據其氨基酸序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTp 上 搜 索 同 家 族CCX 蛋白；
利用MEGA 7.0 構建不同植物CCX 蛋白進化樹；
用NCBI 的Conserved domain 預測蛋白質結構域；
利用DNAMAN 8 軟件將煙草和其他物種的同家族CCX氨基酸序列進行比對。
1.2.4 煙草NtCCX2啟動子的克隆 在NCBI 網站上查找煙草的基因組序列，將該基因上游2 000 bp左右片段作為其啟動子區域，利用NCBI 網站中的Primer-BLAST 設計引物pCCX2-F/pCCX2-R（表1），以野生型K326 煙草基因組DNA 為模板，擴增啟動子片段，將得到的目的片段導入到pMD19-T（TaKaRa，北京）中。
1.2.5 煙草NtCCX2啟動子序列分析 通過PlantCARE 網站分析NtCCX2啟動子中順式作用元件位置、序列及功能。
1.2.6 煙草NtCCX2基因表達分析 利用引物設計軟件Primer Premier 5.0 設計實時熒光定量引物qCCX2-F 和qCCX2-R（表1），以NtActin基因作為內參，用2×SYBR Premix WizTaq酶（諾貝萊，北京）進行熒光定量PCR，采用2-ΔΔCt法計算NtCCX2基因的相對表達量。
1.2.7 Cd 含量檢測 委托河南華測檢測技術有限公司采用石墨爐原子吸收分光光度法測定Cd含量。
2.1 煙草NtCCX2基因的克隆與序列分析
在NCBI 網站上查找擬南芥AtCCX2的氨基酸序列，利用BLASTp查找到煙草CCX2同源基因。該基因全長2 464 bp，CDS 區1 926 bp，編碼641 個氨基酸。以野生型K326 土培煙草的葉片cDNA 為模板進行PCR，得到1 條長度為1 926 bp 的條帶（圖1），該基因編碼641 個氨基酸，GenBank 登錄號為XM_016577905。
圖1 煙草NtCCX2基因的克隆Fig.1 Cloning of NtCCX2 gene in tobacco
基于WOLF PSORT 亞細胞定位預測結果顯示，該蛋白質最可能位于質膜。利用NCBI 的Conserved domain 預測NtCCX2 蛋白結構域發現，該蛋白質在23—439 位氨基酸含有1 個保守的Na+/Ca2+-K+INDEPENDENT EXCHANGER 結構域。NtCCX2 與其他物種CCX2 氨基酸序列比對的結果見圖2。由圖2可知，NtCCX2與馬鈴薯StCCX2和辣椒CaCCX2 的氨基酸序列相似性最高，并具有CCX家族高度保守的特征，在跨膜區有2 個α-重復區域：α1 模式基序GNGAPD 和α2 模式基序G（N/D）SxGD[17‐19]。利用MEGA 7.0 軟件對NtCCX2 同家族21種植物的CCX2 蛋白構建進化樹，結果見圖3，煙草NtCCX2 在進化上與番茄（Solanum lycopersicum，XP 004243702.1）、辣 椒（Capsicum annuum，XP 016580161.1）、馬 鈴 薯（Solanum tuberosum，XP 006342390.1）、曼 陀 羅（Datura stramonium，MCD 9559449.1）CCX 蛋白相似度最高，說明其親緣關系最近，與擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP 564650.1）、水稻（Oryza sativa japonicagroup，XP 015632178.1）等親緣關系次之，而與黃瓜（Cucumis sativus，XP 004144128.1）、冬 瓜（Benincasa hispida，XP 038878908.1）親緣關系最遠。
圖2 CCX2蛋白序列比對分析Fig.2 Multiple sequence alignment of CCX2 proteins
圖3 植物CCX蛋白的系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CCX proteins in plants
2.2 煙草NtCCX2啟動子克隆及順式作用元件分析
以野生型K326 土培煙草的葉片DNA 為模板擴增NtCCX2啟動子，得到1 條長度為2 160 bp 的條帶（圖4），產物純化后連接到T 載體并轉化到大腸桿菌DH5α 中，經過菌液PCR 檢測后送至尚亞生物技術有限公司測序，測序結果與煙草基因組的結果高度相似。
圖4 煙草NtCCX2基因啟動子的克隆Fig.4 Cloning of NtCCX2 promoter in tobacco
用PlantCARE 分析NtCCX2啟動子序列順式作用元件，結果見表2，NtCCX2啟動子包含與光響應有關的元件AE-BOX 和一些植物激素響應元件，如脫落酸應答元件ABRE、茉莉酸應答元件CGTCAmotif、水楊酸響應元件TCA-element 等，表明光、茉莉酸、脫落酸和水楊酸等環境因素可能影響NtCCX2基因的表達。另外，該啟動子區域還包含有植物逆境應答相關元件，如干旱、高鹽、低溫響應元件MYB，說明該基因可能與植物抗逆相關。
表2 煙草NtCCX2基因啟動子部分順式作用元件Tab.2 Cis?acting elements of NtCCX2 promoter in tobacco
2.3 煙草NtCCX2基因的組織特異性表達分析
煙草NtCCX2基因表達具有明顯的組織特異性。圖5顯示，幼苗期和旺長期NtCCX2基因在葉中的相對表達量最高，分別是莖中相對表達量的37.4、6.2 倍，而成熟期NtCCX2基因在根和花中的相對表達量明顯高于莖和葉，分別是莖中相對表達量的5.9、4.1倍，是葉中相對表達量的3.6、2.4倍。
圖5 NtCCX2基因的組織表達模式分析Fig.5 Expression pattern analysis of NtCCX2 gene
2.4 煙草NtCCX2基因對干旱、鹽脅迫的響應
干旱與鹽脅迫是2 種常見的非生物逆境脅迫，NtCCX2基因啟動子中含有干旱與鹽脅迫的響應元件。圖6顯示，干旱脅迫后葉中NtCCX2基因相對表達量是對照的2.1 倍。鹽脅迫后葉中NtCCX2基因相對表達量是對照的5.1 倍，根中相對表達量是對照的3.4 倍。因此，干旱和鹽脅迫均能促進煙草根和葉中NtCCX2基因的表達，在葉中的誘導效應大于根中，表明NtCCX2基因參與煙草的干旱與鹽脅迫響應過程。
圖6 干旱脅迫（A）和NaCl脅迫（B）下NtCCX2基因表達水平Fig.6 Expression of NtCCX2 under drought stress（A）and NaCl stress（B）
2.5 煙草NtCCX2基因對激素信號的響應
干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫會導致植物水分散失，即產生滲透脅迫，進而促進植物激素ABA的合成，因此，ABA 信號通路是植物非生物脅迫反應過程的中樞調節因子[20]。圖7A、7B 顯示，ABA 處理2 h 后，NtCCX2基因在根中相對表達量明顯上調，是0 h 的3.7 倍；
ABA 處理8 h 后，在葉中相對表達量是0 h 的2.1 倍。表明ABA 能夠明顯誘導煙草根和葉中NtCCX2基因的表達，在根中的誘導效應大于葉中，其具體機制尚需進一步研究。MeJA 是響應植物損傷的激素信號分子，外源應用能夠激發植物防御基因的表達。圖7C、7D 顯示，MeJA 處理后，根中NtCCX2基因相對表達量沒有明顯的變化；
MeJA 處理8 h 后，葉中NtCCX2基因相對表達量是0 h 的2.1 倍，表明MeJA 處理8 h 后能夠顯著誘導葉中NtCCX2基因表達。作為一種重要的植物激素，乙烯利不僅在植物生長發育過程中發揮重要作用，也參與植物對干旱、水淹、鹽和低溫等各種非生物脅迫的響應[21]。圖7E、7F 顯示，乙烯利處理2 h 后，NtCCX2基因在根和葉中相對表達量均增加；
處理8 h 后，NtCCX2基因在根中的相對表達量是0 h 的2.4倍；
處理24 h后，NtCCX2基因在葉中的相對表達量是0 h 的5.7 倍。表明乙烯利處理能夠顯著誘導NtCCX2基因的表達。
圖7 煙草NtCCX2基因對ABA（A和B）、MeJA（C和D）和乙烯利（E和F）的響應Fig.7 Response of NtCCX2 to ABA（A and B），MeJA（C and D）and ethylene（E and F）
2.6 煙草NtCCX2基因對Cd脅迫的響應
煙草是一種Cd 富集植物，煙葉中Cd 的含量受到土壤Cd含量、水肥管理等眾多因素的影響。溫室試驗結果顯示（圖8），200 μmol/L Cd 脅迫后，根中NtCCX2基因的相對表達量上調10 倍以上，葉中的表達量上調5 倍以上，1 000 μmol/L Cd 脅迫后根和葉中NtCCX2基因的相對表達量均上調10 倍以上，表明該基因的表達受Cd 脅迫的誘導。根和葉中的Cd 含量也明顯高于對照，表明NtCCX2基因與煙株Cd 的吸收運輸相關。土壤修復劑、植物生長調節劑、營養元素的添加以及現代生物技術的應用是當前重要的控鎘技術措施。大田試驗結果（圖9）顯示，降鎘靈、富硒寶、微量元素肥能夠降低大田煙株根和葉中NtCCX2基因的表達量，減少各部位葉和根的Cd 含量，其中降鎘靈降低下部葉Cd 含量的效果比較明顯，進一步表明NtCCX2基因參與煙株中Cd的吸收與運輸。
圖8 Cd脅迫對NtCCX2基因表達（A）與煙株Cd含量（B）的影響Fig.8 Effects of cadmium stress on NtCCX2 gene expression（A）and cadmium content（B）in tobacco plants
圖9 降鎘藥劑對大田煙株NtCCX2基因表達（A）和Cd含量（B）的影響Fig.9 Effect of cadmium?reducing agents on expression of NtCCX2 gene（A）and cadmium content（B）in tobacco plants
Ca2+/陽離子反轉運蛋白超家族（CaCA）是一類膜定位的離子轉運蛋白，主要包含YRBG、CAX、CCX、NCX和NCKX 5個亞家族成員，CAX和CCX普遍存在于植物中，在植物非生物脅迫響應中起到重要作用[22‐24]。CCX一般有CCX1—CCX5 5個成員，跨膜區是包含2 個α-重復區域的12 個區段，保守的α1 模式基序GNGAPD 和α2 模式基序G（N/D）SxGD分別存在于N-端的第3—4 區段和C-端的第9—10區段[25]，本研究結果表明，NtCCX2具有這種典型的保守結構。
CCX2 參與體內的Na+、K+、Mn2+、Ca2+等的運輸。擬南芥中的CCX 家族具有H+/K+轉運活性，通過調控Ca2+濃度，AtCCX1、AtCCX2、AtCCX3參與干旱、鹽脅迫響應，AtCCX1參與葉片的衰老過程[26]。研究發現，小麥TaCCXs、水稻OsCCX2和OsCCX4的表達受干旱脅迫誘導，而OsCCX2還與Cd 的運輸有關[27‐29]。本研究結果顯示，NtCCX2基因啟動子含有ABA 等激素信號以及抗逆相關的響應元件，其在根和葉中的表達除了受到干旱和鹽脅迫的誘導外，還對ABA、MeJA 和乙烯利產生不同的響應，Ca2+等離子的調控是否也參與這些響應過程尚需進一步研究。另外，本研究結果還表明，Cd 脅迫能顯著增加NtCCX2基因的表達，降鎘靈等降鎘藥劑能夠下調該基因的表達，不僅表明NtCCX2與煙草中Cd 的吸收、累積有關，同時也為降鎘藥劑的推廣使用提供了理論基礎。
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