劉德財，韓學東
（佳木斯大學生命科學學院，黑龍江 佳木斯 154007）
抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）又稱宿主防御肽（Host defence peptides,HDPs），是一類分子組成小于80 個氨基酸、具有抵抗外界病原活性的小分子肽，是生物體免疫系統的重要組成部分。抗菌肽最早發現于果蠅的抗菌系統[1]，隨后從經大腸桿菌和陰溝桿菌誘導的天蠶蛹血淋巴純化獲得具有抗菌活性的多肽，定名為天蠶素（Cecropins）[2,3]。抗菌肽作為生命有機體的天然免疫防御系統，從低等生物到高等生物都能表達。盡管抗菌肽的種類和化學分子構成不同，但具有共同的性質，如帶正電荷、強堿性、分子量小、熱穩定性好、廣譜抗菌性及不易產生耐藥性等特點。近年來，大量濫用抗生素導致病原微生物產生了不同程度的耐藥性，制約了水產養殖業可持續性發展[4,5]。抗菌肽作為一種區別于傳統抗生素的抗菌物質已經被廣泛研究，目前已發現了接近3 000 種動物抗菌肽[6]，在水產養殖領域具有廣闊的應用前景。本文將對水產動物抗菌肽種類、作用機制及研究動態、抗菌肽在水產養殖中的應用現狀以及存在的問題與對策等進行綜述。
1.1 抗菌肽結構
1.1.1 抗菌肽的一級結構
抗菌肽屬于小分子肽，一般由10～80 個氨基酸構成，肽鏈的氮端富含親水性堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸），而碳端富含中性或弱堿性疏水性氨基酸且常被酰胺化；
通常氮端帶正電、碳端呈現電中性。多數抗菌肽一級結構中，第二位通常為色氨酸殘基，中間部分富含脯氨酸殘基，同時也經常出現由半胱氨酸殘基形成的二硫鍵結構[7]。
1.1.2 抗菌肽的二級結構
根據肽鏈的空間二級結構，抗菌肽可分為α-螺旋型抗菌肽、β-折疊型抗菌肽、環狀結構抗菌肽和延展結構抗菌肽。α-螺旋型抗菌肽是為常見，研究得也較多，在液相中以無序結構存在，當與生物膜接觸時，就會呈現具有雙親性α-螺旋的二級結構，發揮其生物學活性，如Piscidins[8]、Gaduscidins[9]和Pardaxin[10]等；
β-折疊型抗菌肽廣泛存于海洋無脊椎動物、兩棲類動物中。與α 螺旋型抗菌肽不同，β-折疊型抗菌肽含有保守性的半胱氨酸殘基，可在肽鏈中形成較為穩定的二硫鍵，增加了結構的穩定性，在水相中仍然保持有序的穩定結構[10]，如Cathelicidin[11-13]、Defensins[14,15]、Hepcidin[16,17]等；
環狀結構抗菌肽和延展型抗菌肽，一級結構與組蛋白H1、H2 相似，含有較高比例的精氨酸、色氨酸或脯氨酸殘基無法折疊成規則的二級結構，如Parasin[18]、HPL-1[19]等。
1.2 抗菌肽作用機制
抗菌肽發揮生物學功能的機制與自身的結構特性密切相關，主要可以分為膜結構破壞模式和非膜結構破壞模式。
1.2.1 膜結構破壞模式
目前認為，絕大多數抗菌肽是通過膜結構破壞模式發揮抗菌作用。抗菌肽基于自身物化性質和結構特征，插入到細胞膜雙分子層中，破壞細胞膜的完整性，引起細胞內容物外流甚至膜的破裂，抑制細菌的生物合成和繁殖進而殺滅細菌。膜結構破壞模式主要有四種模型假設，即板-桶模型[20]、地毯模型[21]、環形模型[22]和凝聚模型[23]。抗菌肽理化特性是膜結構破壞的關鍵，改變抗菌肽的結構可提高其抗菌活性[24-26]。
1.2.2 非膜結構破壞模式
少數抗菌肽可以在不破壞細胞膜結構的情況下，通過滲透作用快速進入細胞膜內部，與細胞膜內的生物活性分子相互結合，影響細菌內部核酸分子、蛋白質的生物合成等生理過程，發揮抑菌或殺菌的生物活性[27,28]。
1.3 生物學功能
1.3.1 廣譜抗菌活性
研究表明，大多數抗菌肽具有廣譜的（革蘭氏陽性和革蘭氏陰性）抑制或殺滅細菌的活性。體外抗菌性試驗表明，東北林蛙（Rana chensinensis）抗菌肽可抑制革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus）、格蘭仕陰性菌（銅綠色假單孢菌Pseudomonas aeruginosa和大腸桿菌Escherichia coli），對其多種耐藥菌株仍有抑制作用[29]。盡管抗菌肽的抗菌譜廣，但是，也存在差異，如對蝦的Penaeidins抗菌肽對革蘭氏陰性細菌的抑菌活性就較低[30]。
1.3.2 抗真菌
抗菌肽除了對細菌具有廣譜的抗菌作用外，對某些種類的真菌也有一定的抑制殺滅作用。抗菌肽抑制真菌的作用機理多種多樣，抑制真菌的主要機制是干擾真菌細胞裂變和細胞壁的形成[31-33]，及通過鈣離子內流、鉀離子外滲等機制干擾真菌繁殖[32]。
1.3.3 抗病毒
一些抗菌肽能夠抑制部分帶有包膜的病毒在細胞間的傳播[34]，體現抗病毒的活性。抗菌肽與病毒之間有兩種抑制關系：一是多種類型的抗菌肽對同一種病毒起作用，另一種是一種抗菌肽可與多種類型的病毒起作用。目前的研究結果表明，抗菌肽對具有包膜結構的DNA 和RNA 病毒的有抗病毒活性要強于無包膜的病毒[33]，如magainin 家族、brevinin-1 家族等的抗菌肽對皰疹病毒、流感病毒等有包膜病毒具有抗病毒活性[35]。
1.3.4 免疫調節作用
并非所有抗菌肽都是通過作用于微生物而發揮生物學活性，有的抗菌肽（如HBD、Cathelicidin等）可以對宿主進行免疫調節，增強有機體的非特異性免疫功能，發揮抑菌功能，如降低細菌內毒素引起的炎癥反應、誘導巨噬細胞聚集和促炎癥分子的合成等[36-38]。
1.4 抗菌肽來源
抗菌肽廣泛分布于多種自然生物中，如植物、昆蟲、兩棲動物、哺乳動物等。除上述自然界天然抗菌肽外，隨著生物技術、酶化學和基因工程的快速發展，人工抗菌肽已成為抗菌肽的發展方向。
1.4.1 天然抗菌肽
天然抗菌肽是由有機體自主產生，通過萃取、濃縮、提純而獲得的抗菌肽，人類獲得的第一個天然抗菌肽是天蠶素（Cecropins）。高等動物的抗菌肽主要來源于體內血液細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞[39]，此外在上皮細胞、脂肪細胞和生殖系統中也有分布[12,14,16,29]。
1.4.2 人工抗菌肽
盡管天然抗菌肽的來源豐富，但是含量很低、獲取成本昂貴，難以在生產實踐中廣泛使用，目前獲取抗菌素的主要來源是人工制備。較為成熟的人工制備抗菌肽的方法有三種：一是根據抗菌肽氨基酸序列，通過化學合成的方法獲得抗菌肽[40-43]；
二是通過基因工程技術，將編碼抗菌肽的基因導入到表達載體內（酵母、大腸桿菌等），獲得產量較高的抗菌肽[41,42]；
三是通過蛋白酶催化水解特定蛋白質（牛乳鐵蛋白、卵白蛋白和乳酪蛋白等）獲得具有抗菌活性的多肽[44-47]。
2.1 水生無脊椎動物抗菌肽
貝類、甲殼類等水生無脊椎動物特異性免疫系統，主要依靠先天免疫系統抵御外界微生物的侵害。水生無脊椎動物體內含有豐富的防御黏液，其中富含抗菌肽，能夠幫助水生無脊椎動物抵御病原微生物的侵害，因此抗菌肽對于缺少特異性免疫系統的無脊椎動物具有更為重要的意義。
2.1.1 水生貝類
在水生貝類抗菌肽的研究中，有關貽貝抗菌肽的研究較早且較為透徹[48]。貽貝抗菌肽的氨基酸組成中半胱氨酸含量豐富，生理狀態下帶有正電，依據多肽的一級結構特征可分為四類：貽貝素（Mytilins）、防御素（Defensins）、貽貝肽（Myticins）和貽貝霉素（Mytimycins）[48]。貽貝素屬于血細胞和血清的抗菌肽，是貽貝中發現種類最多含量最大的抗菌肽家族，在地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）、厚殼貽貝（M.coruscus）和紫貽貝（M.edulis）等主要貽貝中均有發現。主要包含五種類型：Mytilin A、Mytilin B、Mytilin C、Mytilin D 和Mytilin G1，每種類型對細菌和真菌的抗菌性表現出不同活性，其中Mytilin B 和Mytilin D 具有廣譜抗菌性（包括真菌）；
Mytilin C 和Mytilin A 對革蘭氏陽性和陰性菌都有效果，而MytilinG1 只對革蘭氏陽性細菌有抗菌活性[49]。MGD 1、MGD 2、Mytilus defensins A 和Mytilus defensins B 等貽貝防御素具有典型帶正電的疏水性側鏈，對革蘭氏陽性菌具有特異性的抗菌活性[50]。貽貝肽已經鑒定到Myticin A、Myticin B 和Myticin C三種[49,51]。它們主要分布在血液細胞和血漿中，而Myticin C 是一種分子多態性高的抗菌肽[51,52]。貽貝霉素的功能核心是由十六個半胱氨酸殘基所構成，具有嚴格意義上的抗真菌活性[53,54]。
除貽貝抗菌肽以外，牡蠣、蛤類、盤鮑（Haliotis discus）等水生貝類的抗菌肽研究也逐漸增多。在牡蠣抗菌肽中已鑒定出大防御素家族（Big defensins）。該類抗菌肽結構特征是包含一段由六個半胱氨酸殘基組成的高度疏水氮端區域和三個二硫鍵陽離子碳端區域[55]。青蛤（Cyclina sinensis）閉殼肌表達Mytimacin 成熟肽，在外套膜具有最高的表達量，具有較強的抑制微生物活性[56]。通過多步高效液相色譜結合質譜分析,在馬氏珠母貝（Pinctada martensii）血清中鑒定到分子質量在5 kDa 的具有抗菌活性的多肽，通透射電鏡觀察其抑菌作用機制[57]。在盤鮑肝臟中獲得由42 個氨基酸殘基組成的分子量為4 kDa的抗菌肽，當機體受到革蘭氏陽性和陰性細菌刺激會在肝臟中表達[58]。
2.1.2 水生甲殼類
水生甲殼動物抗菌肽的研究始于海岸蟹（Carcinus maenas）血細胞中獲得富含脯氨酸、分子量為6.5 kDa的廣譜抗菌肽[59]。甲殼類抗菌肽主要分為三類：對蝦素（Penaeidins）、甲殼素（Crustin）和抗脂多糖因子（ALF）。對蝦素是一類具有三個二硫鍵的陽離子抗菌肽，已在多種對蝦中發現，如中國對蝦（Penaeus chinensis）、斑節對蝦（Penaeus monodon）和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）等，其氮端富含脯氨酸和精氨酸、碳段富含半胱氨酸，對革蘭氏陽性菌和真菌有較好的抑制效果，但是對革蘭氏陰性菌的作用較弱[60-63]；
甲殼素是一類富含半胱氨酸、在碳端含有一個乳清酸蛋白結構的陽離子抗菌肽，分子量7～14 kDa，主要存在于蟹、鰲蝦和對蝦等甲殼動物中，具有抗病毒、抗菌、抑制蛋白酶活性等功能；
抗脂多糖因子是一種具有脂多糖結合結構的陽離子抗菌肽。該類抗菌肽通過與脂多糖結合激活細胞內的凝血級聯反應，具有內毒素結合和廣譜抗菌抗病毒活性，已見于斑節對蝦、日本囊對蝦（Penaeus japonicus）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）等[64-68]。除以上三類研究較多的抗菌肽之外，近幾年在水生甲殼動物中還發現很多新型的抗菌肽，如在擬穴青蟹（Scylla paramamosain）精漿中分離到的陰離子抗菌肽Scygonadin 和SCY2[69,70]、擬穴青蟹血細胞分離到Sphistin 抗菌肽[71]、蜘蛛蟹（Hyas araneu）抗菌肽Arasin[72]和Hyastatin[73]等。
2.2 水生脊椎動物抗菌肽
水產脊椎動物主要有魚類和兩棲類。魚類最主要，在淡水湖泊、河流和海洋中廣泛分布。水環境中富含各種微生物，嚴重威脅魚類健康。抗菌肽作為非特異性免疫因子可以有效保護魚類免受病原微生物的侵害。兩棲類動物長期生活在溫暖潮濕的環境中，皮膚裸露于環境中，易受病原微生物的影響，在長期進化中兩棲動物的天然免疫系統能夠產生種類豐富的抗菌肽。
2.2.1 魚類
按照結構特點魚類抗菌肽可分為兩大類，一類是不含半胱氨酸具有疏水性或雙親性α 螺旋結構的抗菌肽，包括Piscidins、Pleurocidins 和Misgurins等；
另一類是含有多個半胱氨酸β 折疊結構的抗菌肽，如Hepcidin、Cathelicidins 等。
Piscidins 類抗菌肽是魚類中最常見的抗菌肽家族之一。這個家族成熟肽富含組氨酸和苯丙氨酸，長度一般為18～26，目前已在莫桑羅非魚（Tilapia mossambica）、條紋鱸（Morone saxatilis）和條石鯛（Oplegnathus fasciatus）中發現5 個亞型，主要在鰓、皮膚和腸表達，除了具有廣譜抗菌性外，還具有抗真菌、抗寄生蟲和抗病毒的活性[74-76]。
Defensin 類抗菌肽含有18～45 個氨基酸殘基，呈陽離子，其中包含6～8 個保守的半胱氨酸，具有廣譜的抗微生物活性。魚類的Defensin 抗菌肽均屬于β-Defensin 亞型，在斑馬魚、虹鱒等魚的肝臟、肌肉、皮膚、腸道和鰓等多種組織中表達[14,15,77]。
Hepcidin 又稱鐵調素是一種富含半胱氨酸的抗菌多肽，其前肽含有85 個氨基酸殘基，包含信號肽、前肽和成熟肽三部分。前肽轉化酶通過識別Hepcidin 的碳端高度保守的R-X-K/R-R 結構進行前肽酶切，形成有活性的成熟Hepcidin 抗菌肽[78]。魚類Hepcidin 可抑制革蘭氏陽性和陰性細菌、病毒、寄生蟲，還作為免疫調節因子調控魚類的免疫功能，參與肝細胞和巨噬細胞鐵釋放的調控[16,17,79]。
Cathelicidins 是一種含有多脯氨酸型結構域（Cathelin 結構域）的陽離子抗菌肽，成熟肽氨基酸殘基的長度在12～80。該類抗菌肽在鰓、肝臟、脾臟和腸道的上皮組織中均有表達，具有廣譜的殺菌作用[11-13]。
2.2.2 兩棲類動物
兩棲類動物的皮膚需要時刻保持濕潤狀態，保持呼吸功能。這種潮濕裸露的皮膚特點為病原微生物的生存提供了極好的環境。為提高生存能力兩棲動物形成了強大的皮膚抗菌肽免疫體統，主要包括Bombinins、Cathelicidins、Esculentins 和Temporins 等抗菌肽。
Bombinins 抗菌肽最早在東方鈴蟾（Bombina orientalis）皮膚中鑒定到。該類抗菌肽分為BLPs 抗菌肽和H 型Bombinins 抗菌肽，是α 螺旋二級結構的雙親性陽離子抗菌肽。這兩種抗菌肽來源于共同的前體，通常由于氮端的第二個氨基酸手性的不同而形成抗菌肽的同分異構體。BLPs 抗菌肽有25～27個氨基酸組成，對革蘭氏陽性和陰性細菌、真菌有活性。H 型Bombinins 抗菌肽由17～20 個氨基酸組成，殺菌活性低于BLPs 抗菌肽，但是，溶血活性高于BLPs 抗菌肽[80,81]。
所有脊椎動物都有Cathelicidins 抗菌肽家族，也是兩棲類動物重要的抗菌肽。兩棲動物的Cathelicidins 抗菌肽的生物合成與其他有脊椎動物存在一定差異。兩棲動物主要通過類胰蛋白酶切割，使前體肽成為成熟肽。兩棲動物Cathelicidins 抗菌肽除具有高效廣譜的抗菌活性，還具有如抑制組織損傷和促進血管生成等多種重要生物活性，已在中國大鯢（Andrias davidianus）、中華蟾蜍（Bufo gargarizans）和牛蛙（Rana catesbiana）等14 種兩棲動物中鑒定到該家族抗菌肽[82]。
Temporin 屬于α 螺旋雙親性的陽離子抗菌肽，氨基酸序列長度較短，通常為13 個氨基酸，在中性pH 下具有較低的凈正電荷，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均有抑菌活性[82]。該類抗菌肽的抗菌活性已在多種蛙類中鑒定和研究，其中Temporin A、B 和L 抗菌肽中研究最多的是Temporin 類抗菌肽。Temporin A 氮端疏水殘基和5、12 位大量疏水殘基是抑菌活性的重要決定因素，其對革蘭氏陽性菌抗菌活性較高。Temporin L 具有較高的抗菌活性，特別是對真菌病原體和革蘭氏陰性菌[82]。
3.1 提高生長性能
飼料系數、特定生長率與增重率是體現水產動物生長的關鍵指標。飼料中添加一定比例的抗菌肽可明顯提高水產動物的生長性能。董曉慶等[83]在飼料中添加400 mg/kg 天蠶素，建鯉魚種的增重率增高（P＜0.05）、飼料系數降低（P＜0.05）。王自蕊等[84]發現，飼料中添加150 mg/kg 天蠶素抗菌肽，湘云鯽的增重率和特定生長率提高了37.4%和27.5%（P＜0.05）。陳冰等[85]通過8 周的生長實驗表明，添加家蠅幼蟲抗菌肽提取物在2 000～3 000 mg/kg 范圍內時，使初始體質量0.86 g 的凡納濱對蝦增重率、飼料效率和特定生長率顯著提高（P＜0.05）。Zhou 等[86]將10 mg/kg、15 mg/kg 和30 mg/kg 的蜜蜂抗菌肽（Apidaecin）添加到建鯉基礎飼料中，飼料轉化率與生長性能較對照組顯著升稿（P＜0.05）。上述研究證實，飼料中添加抗菌肽可以提升水產動物的生長性能，但是，其功效水平與應用計量、動物種類、個體大小、抗菌肽種類等因素有關。
3.2 提升免疫功能及抗氧化能力
水產動物的免疫功能主要包括特異性免疫和非特異性免疫。抗菌肽能夠提升水產動物血液中溶菌酶、超氧化物歧化酶和磷酸酶等的非特異性免疫因子活性，增加機體免疫力，提升機體對有害病原體的防御能力。胡世康等[87]、柴仙琦等[88]均驗證：飼喂添加抗菌肽的飼料可以顯著提升凡納濱對蝦血清中超氧化物歧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶的活性（P＜0.05）。姜珊等[89]在吉富羅非魚飼料中添加重組中國對蝦抗菌肽,并于實驗結束時注射嗜水氣單胞菌攻毒，結果添加5 mg/kg 抗菌肽可以顯著提高羅非魚過氧化物酶體的活性,存活率最高（P＜0.05）。給錦鯉（Cyprinus carpio haematopterus）[90]、銀鯽（Carassius auratus gibelio）[91]、花鱸（Lateolabrax japonicus）[92]和河蟹（Eriocheir sinensis）[93]飼喂添加抗菌肽飼料，均表現出抗氧化能力和免疫功能的提升。
3.3 促進水產動物腸道健康
外源性抗菌肽主要通過飼料進入水產動物消化系統，與腸道微生物相互作用影響水產動物的腸道健康。抗菌肽可從腸道菌群、腸道組織結構和腸道消化酶活性三個方面影響腸道健康。蘇保元[94]比較了兩種抗菌肽對斜帶石斑（Epinephelus coioides）魚腸道菌群的影響。結果表明：添加抗菌肽均能增加斜帶石斑魚腸道內總菌和乳酸菌數量、降低致病性弧菌數量，其中天蠶素的效果更好。翟少偉等[95]研究表明：添加不同水平Surfactin 抗菌肽均能顯著增加吉富羅非魚腸道腸黏膜的相對表面積、皺褶高度，促進腸道吸收功能，其中50 mg/kg 組腸道褶皺高度較對照組增加了0.7 倍。飼料中添加抗菌肽還能顯著提高吉富羅非魚和鯉（Cyprinus carpio）腸道脂肪酶和蛋白酶的活性[96,97]。
隨著高密度、集約化水產養殖的發展，在過度使用抗生素的背景下，尋求抗生素替代物成為當下的趨勢[98]。研究和應用抗菌肽可有效降低水產養殖中抗生素的濫用，改善水產品的品質，促進水產養殖業綠色健康發展。抗菌肽雖然具有諸多優點，如分子量小、廣譜抗菌性、不易產生耐藥性和較好的食品安全性等，但仍存在著亟待解決的問題。一是提高獲取抗菌肽的能力。從生物體直接提取純化抗菌肽，含量低、資源受限、成本高，無法大規模批量生產。通過化學合成的方式制備小分子抗菌肽，難以保持抗菌肽的活性構象，合成成本較高。蛋白酶水解抗菌蛋白可以大批量、低成本地獲取具有抗菌活性的水解產物，但水解產物中非抗菌活性產物較多，使用安全性難以完全掌控。利用基因工程方法獲取抗菌肽，表達載體菌容易分泌蛋白酶使抗菌肽降解，同時抗菌肽的產生會抑制甚至殺滅表達載體菌。二是提高抗菌肽的抗菌活力。抗菌肽雖然能夠替代抗生素預防水產動物疾病，但抗菌肽的抗菌譜及活力與傳統抗生素的抗菌效果還有差距。三是抗菌肽藥用機理問題。在水產養殖臨床應用上，缺乏深入的對抗菌肽的毒理性及藥理藥效研究，特別是在使用劑量、給藥方式和作用時間等內容還需要深入研究。因此，加快對應用于水產養殖領域抗菌肽的制備、飼料添加量等方面的研究迫在眉睫，這將對水產養殖業的可持續發展起到重要的作用。
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