劉芝妤，李增平，張 宇
（海南大學 植物保護學院/熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，?？?570228）
大葉紫薇[Lagetstroemia speciosa（L.） Pers.]，又稱大花紫薇，原產于亞洲的熱帶地區(qū)，在我國的海南、廣東、廣西、四川、云南等省均有種植。大葉紫薇具有校高的藥用價值和觀賞價值，其提取物具有斂瘡、解毒、涼血止血等功效，同時，園林綠化種植大葉紫薇移栽成活率極高，全年可觀花的時間長達7個月[1?2]。2001年，朱愛萍等[3]對紫薇的白粉?。║ncinula austruliana）進行了生物學特性和致病性研究。2007年，翁殊斐等[4]對大花紫薇進行病蟲害檢索表的編制與綜合防治，主要報道了大葉紫薇的斑點病（Phyllosticta lagerstroemiae）以 及 炭 疽 ?。–olletotrichum gloeosporioides）。2009年，吳建民[5]對大葉紫薇褐斑?。˙rown spot）和煤污?。⊿ooty mold）的癥狀、發(fā)生規(guī)律以及防治方法進行了報道。炭疽菌引起的植物炭疽病可導致寄主植物出現(xiàn)葉斑、枝枯等癥狀，甚至出現(xiàn)植株枯死。嚴重的植物炭疽病還可導致在種植產業(yè)上發(fā)生重大的經濟損失。膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是一種常見的引發(fā)多種植物炭疽病的病原真菌，其侵染的寄主種類豐富，分布范圍廣，但近年來發(fā)現(xiàn)其包含有多個復合種，炭疽病在我國雖有大量報道，但對熱帶林木炭疽病的調查以及鑒定偏少[6]。目前，只有少量的文獻中提及到大葉紫薇炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌，但是尚未見到大葉紫薇炭疽病的致病性測定、分子鑒定及生物學特性等方面的詳細報道。因此，筆者在海南發(fā)現(xiàn)的大葉紫薇炭疽病病樹上采集病葉，并進行病原菌的分離培養(yǎng)和致病性測定，同時采用形態(tài)學結合分子生物學手段進行病原菌的種類鑒定及其生物學特性研究，旨在進一步明確大葉紫薇炭疽病的病原菌種類，為后續(xù)研究其發(fā)病規(guī)律及診斷防治等提供理論依據(jù)。
1.1 研究材料大葉紫薇炭疽病病葉，于2020?12?13從海南省?？谑惺兰o公園發(fā)病的大葉紫薇上采集病葉，帶回實驗室進行室內鏡檢，初步鑒定后分離菌株，并制作病葉標本保存，保存于實驗室。
1.2 培養(yǎng)基PDA[Potato Dextrose Agar(Medium)]、PSA(Potato Saccharose Agar)、OMA(Oatmeal Agar)、CA(Cellulose Acetate)、CMA(Corn Meal Agar)、Czapek(Czapek Dox Agar)[7?8]。
1.3 試劑及儀器DNA提取試劑盒OMEGA Fungal DNA Kit購自美國OMEGA公司，2×Taqplus PCR Master Mix購自Biosharp公司。攝影生物顯微鏡為日本Olympus BX-51。
1.4 菌株的分離純化采用常規(guī)的組織分離法，將病葉從病健交界處切取5 mm左右的小塊，放入酒精中浸泡10 s后再放入0.1%升汞溶液中浸泡1 min，最后用滅菌水沖洗3次，置于空白培養(yǎng)皿風干并放置到PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。28 ℃恒溫黑暗條件下于斜面上保存分離得到的菌株備用。待菌絲生長到適宜大小，產孢后，再進行單孢分離純化，從多個生長相同的菌株中選擇生長良好的菌株，編號備用（菌株編號為DYZWTJ001）[9]。
1.5 致病性的測定將經28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d的DYZWTJ001菌株的PDA平板用打孔器打成直徑（d）為5 mm的菌餅。采用刺傷和無傷接種法，將菌絲面緊貼于經表面消毒處理的健康大葉紫薇葉片傷口上。對照接無菌的PDA。DYZWTJ001菌株經28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，收集分生孢子，用無菌水洗脫菌落表面的分生孢子，制成分生孢子濃度為2×106個·mL?1的懸浮液；
將一部分孢子懸浮液滴到經表面消毒處理的健康大葉紫薇葉片傷口上，將另一部分孢子懸浮液噴施在無刺傷的嫩葉上，對照接無菌水[10]。將接種好的葉片保濕后放置到（28±0.5）℃的黑暗培養(yǎng)箱中，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，并定期觀察其發(fā)病情況，每處理設置3個重復。
1.6 病原菌的形態(tài)學鑒定DYZWTJ001菌株培養(yǎng)7 d后，觀察菌落的正、反面顏色及邊緣形狀。挑取培養(yǎng)物用攝影生物顯微鏡對病原菌的顯微結構進行拍照、觀察和測量。觀察分生孢子盤以及分生孢子，記錄其形態(tài)特征并測量分生孢子盤以及分生孢子的大小。
1.7 病原菌的分子鑒定將DYZWTJ001菌株置于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，使用OMEGA Fungal DNA Kit提取其總DNA。采用通用引物ITS[11](ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、ACT[12](ACT-512F:5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′:ACT-783R:5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′)、GADPH[13](GDF:5′-GCCGTCAACGACCCCTTCAT TGA-3′;GDR:5′-GGGTGGAGTCGTACTTGAGC ATGT-3′)和 CHS[12](CHS-97F:5′-TGGGGCAAGG ATGCTTGGTTGAAG-3′;CHS-354R:5′-TGGAAG AACCATCTGTGAGAGTTG-3′)進行PCR擴增[14?15]。將擴增產物純化、回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。將所獲的序列在 NCBI 進行Blast比對，并提交序列。用Sequence Matrix軟 件 進 行 序 列 拼 接，使 用MEGA7.0軟件以最大似然法（Maximum Likelihood）構建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。
1.8DYZWTJ001菌株生物學特性的測定選用PDA、PSA、OMA、CA、CMA、Czapek培養(yǎng)基制作平板，用于測試DYZWTJ001菌株在不同培養(yǎng)基上的生長影響。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂10 g、蒸餾水1 000 mL；
PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；
OMA培養(yǎng)基：燕麥片30 g、蒸餾水1 000 mL、瓊脂20 g，在60 ℃下水浴1 h，雙層紗布過濾去渣，補足水至1 000 mL，加入瓊脂；
CA培養(yǎng)基：新鮮胡蘿卜200 g切成小片，加蒸餾水500 mL，用組織搗碎機搗碎約40 s，用4層紗布過濾去渣，補足水至1 000 mL，加入瓊脂13 g；
CMA培養(yǎng)基：玉米粉300 g、蒸餾水1 000 mL、瓊脂20 g，在60 ℃下水浴1 h，雙層紗布過濾去渣，上清液補足水至1 000 mL，加入瓊脂；
Czapek培養(yǎng)基：七水硫酸鎂0.5 g、磷酸氫鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硝酸鈉2 g、蔗糖30 g、七水硫酸亞鐵0.01 g、水1 000 mL。將菌株DYZWTJ001菌絲塊置于平板中央，在相同溫度（28 ℃）下培養(yǎng)5 d后，使用十字交叉法量取菌落的直徑，每個處理重復3次。
測試不同溫度條件下DYZWTJ001菌株生長的影響。在超凈工作臺里用直徑0.5 mm打孔器從菌株DYZWTJ001菌落邊緣取菌絲塊，將菌絲塊接種在PDA平板上，分別置于10、15、20、25、28、33、35 ℃共7個不同溫度條件下進行恒溫暗培養(yǎng)，5 d后使用十字交叉法量取其菌落的直徑，每個處理重復3次。
測試不同pH值條件下DYZWTJ001菌株生長的影響。將已滅菌的PDA培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，使用1 mol·L?1的 HCl溶液和1 mol·L?1的NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的pH值調至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 共12個梯度后倒平板上，挑取菌株DYZWTJ001菌絲塊置于平板中央，在28 ℃下培養(yǎng)，5 d后使用十字交叉法量取其菌落的直徑，每個處理重復3次。
測試不同光照條件下DYZWTJ001菌株生長的影響。將菌株DYZWTJ001菌絲塊接種于PDA平板中央，在28℃下分別置于光照24 h、黑暗24 h和光照：黑暗=12 h∶12 h條件下培養(yǎng)，5 d后使用十字交叉法量取其菌落的直徑，每個處理重復3次。
1.9 數(shù)據(jù)處理利用SAS 8.1軟件和Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s multiple range test進行差異顯著性分析。
2.1 大葉紫薇炭疽病的發(fā)病癥狀在海南發(fā)現(xiàn)的大葉紫薇炭疽病主要危害下層老葉。病斑多出現(xiàn)在葉尖和葉緣，葉面上也有少量發(fā)生。發(fā)病初期，在病葉上呈現(xiàn)紅褐色小斑點，邊緣具明顯的亮黃色暈圈，繼而病斑擴展為半圓形或不規(guī)則，褐色至灰白色，邊緣具2～5 mm寬的紫紅色或深褐色壞死帶，病斑的外圍出現(xiàn)明顯的亮黃色的暈圈。潮濕條件下，病斑中央輪生小黑點。后期部分老病斑中央組織破裂出現(xiàn)穿孔，重病葉易脫落。
2.2 致病性的測定大葉紫薇炭疽病的致病性測定結果顯示，接種3 d后，滴加分生孢子懸浮液在刺傷部分的老葉和噴施分生孢子懸浮液在無刺傷的嫩葉的處理均發(fā)??；
接種4 d后，使用菌餅刺傷接種的老葉發(fā)病，老葉上未刺傷部分接種菌餅部分全部未發(fā)病，對照區(qū)域也未出現(xiàn)病變。接種7 d后，觀察到葉片接種部位出現(xiàn)橘紅色分生孢子團（圖1）。從接種發(fā)病部位再分離獲得的菌株與最初分離的DYZWTJ001菌株形態(tài)相同，證明DYZWTJ001菌株為大葉紫薇炭疽病的病原菌。
圖1 大葉紫薇炭疽病的致病性測定結果
2.3 病原菌的形態(tài)學鑒定病原菌在自然生長5 d后的PDA培養(yǎng)基表面菌落的平均直徑為6.9 cm。觀察到其菌落上的菌絲非常的致密，表面蓬松，中心呈灰色，邊緣呈白色，背面中心呈橘紅色，邊緣呈白色。分生孢子為單胞，整體呈現(xiàn)圓柱狀，兩端無色且鈍圓，大小為（13.59～15.83）μm×（4.60～6.51）μm。分生孢子盤褐色，橢圓形，大小為（72.27～77.05）μm×（35.25～37.46）μm（圖2）。
圖2 大葉紫薇炭疽病病菌形態(tài)
2.4 病原菌的分子鑒定將測序后的各基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲得序列號，獲得DYZWTJ001菌株的 rDNA-ITS、ACT 、GADPH和CHS序列長度分別為550 bp（NCBI 登錄號為MZ955449） 、257 bp（NCBI 登錄號為MZ955450）、251 bp（登錄號為MZ955451）和283 bp（登錄號為OM867674）。在NCBI數(shù)據(jù)庫中選取 rDNA-ITS、ACT 和GADPH相關基因序列（表1），將3種序列拼接，利用MEGA 7.0軟件聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果（圖3）表明，菌株DYZWTJ001與隱秘刺盤孢的遺傳距離最小，在93%水平上聚為一支。結合形態(tài)學鑒定，確定DYZWTJ001菌株為隱秘刺盤孢（Colletotrichum aenigma）。
表1 參考菌株及其GeneBank登錄號
圖3 基于 rDNA-ITS、ACT、GAPDH及CHS序列基礎的菌株 DYZWTJ001 與其他炭疽菌相關種的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.5 生物學特性
2.5.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響DYZWTJ001菌株均能在6種培養(yǎng)基上生長，其菌絲生長速度依次為PDA>PSA>CA>OMA>Czapek>CMA（表2）。培養(yǎng)基PDA和PSA下菌絲生長情況差異不顯著（P<0.05）。
表2 不同培養(yǎng)基對DYZWTJ001菌絲生長的影響
2.5.2 不同溫度對菌絲生長的影響菌株DYZWTJ001在不同梯度溫度環(huán)境下培養(yǎng)5 d后，在20～32 ℃條件下均能生長，而在10 、15 、35 ℃條件下不能生長。20～30 ℃內，隨溫度的升高，菌落生長速度顯著加快，30 ℃時病原菌菌落生長速度最快，菌落直徑為6.92 cm，其次是28 ℃時病原菌菌落生長速度較快，菌落直徑為6.70 cm，這兩個溫度下的菌落直徑與其他溫度下的菌落直徑存在顯著性差異（P<0.05），因此認定30 ℃為此炭疽菌最適生長溫度；
從30～32 ℃，菌絲生長速度隨溫度的升高而下降，到35 ℃時，病原菌完全停止生長（圖4）。
圖4 不同溫度培養(yǎng)DYZWTJ001菌株的菌落直徑
2.5.3 不同pH對菌絲生長的影響菌 株DYZWTJ001在pH值為2時菌絲不能生長，在pH值3～13環(huán) 境 下 均 能 生 長。其 中，pH值 為8時，菌絲生長速度最快，菌落直徑為5.86 cm，與其他pH值下的菌落直徑存在顯著性差異（P<0.05）；
之后隨著pH值的升高，菌絲生長速率逐漸下降（圖5），表明堿性條件比弱酸性條件更有利于菌絲的生長。
圖5 不同 pH 條件下DYZWTJ001菌株的菌落直徑
2.5.4 不同光照對菌絲生長的影響菌 株DYZWTJ001在不同光照條件下均能生長。在黑暗環(huán)境下，其生長速率最快，菌落直徑達6.89 cm；
全光處理次之，菌落直徑達3.80 cm；
光∶暗=12 h∶12 h處理生長最慢，菌落直徑達3.81 cm（圖6）；
光∶暗=12 h∶12 h處理和全光照處理間差異不顯著（P<0.05），可見不同光照條件對此炭疽菌菌絲生長影響不大。
圖6 不同光照下 DYZWTJ001 菌株的菌落直徑
本研究通過對大葉紫薇炭疽病的病原菌進行室內分離、純化及致病性測定。利用ITS、ACT、GAPDH和CHS多基因序列分別對代表性菌株DYZWTJ001進行分子鑒定，確定該病原菌為隱秘刺盤孢（Colletotrichum aenigma）。進一步明確了引起海南大葉紫薇炭疽病的病原菌為隱秘刺盤孢。已有報道隱秘刺盤孢可引發(fā)蘋果、辣椒、白木香、楊樹等多種植物的炭疽病，這類病害主要分布在高溫濕熱的熱帶和亞熱帶地區(qū)，其寄主范圍十分廣泛[17]。大葉紫薇炭疽病菌的致病性研究結果表明，嫩葉的致病力顯著高于老葉，老葉在刺傷的情況下才會發(fā)病，且嫩葉發(fā)病早于老葉，在嫩葉上接種發(fā)病擴散速度明顯高于老葉。在老葉上，孢子懸浮液的侵染速度明顯快于菌塊，且病葉上極易產生大量分生孢子堆，可能會成為大葉紫薇炭疽病害傳播的重要侵染源。因此，在大葉紫薇炭疽病防治階段可以著重觀測嫩葉上病害的發(fā)病情況，同時對于發(fā)病樹葉以及病殘體進行及時的清理，從而較好地防治大葉紫薇炭疽病。
顯微鏡下形態(tài)學觀察其分生孢子無色，中間有油滴，單胞，呈長橢圓形狀，這與前人研究結果基本一致[18]。通過對DYZWTJ001生物學特性研究結果表明，該菌株在20～32 ℃條件下均能生長，最適宜溫度為30 ℃，這與前人研究炭疽菌結果基本一致[19]。DYZWTJ001在pH值3～13環(huán)境下均能生長，說明該菌株對于酸堿度的適應范圍很廣，對于強酸強堿環(huán)境也具有較強的適應性，其中最適宜的pH為8。培養(yǎng)基PDA與PSA的培養(yǎng)效果較好，這與前人的研究報道存在一定差異[20]，可能是由于寄主植物不同，分離所獲得的熱帶炭疽菌存在小種或生物型差異，而適宜該菌株的光照培養(yǎng)條件為24 h全黑暗，光照對其菌絲生長有抑制作用。因此，海南全年暖熱，陰雨多濕，往往會引起大葉紫薇炭疽病發(fā)病擴散，對于高溫多雨季節(jié)，應當加強防控，避免病害進一步加重以及擴散。
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