張 鳳,田艷花,牛四坤,臺晶杰,劉文娟
山西藥科職業學院,山西 太原 030031
細胞因子是由細胞分泌的一類具有調節細胞生長、分化和免疫活性的蛋白質。其是由免疫細胞(單核/巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等)和某些非免疫細胞(血管內皮細胞、表皮細胞和成纖維細胞等)經刺激而合成并分泌的一類生物活性分子,它們介導免疫細胞之間的信息交換與相互調節,參與免疫應答和炎癥反應過程[1]。自1957年發現干擾素以來,已有200余種細胞因子被發現。細胞因子種類很多,命名方法也不盡統一。白細胞介素(interleukin,IL)是由淋巴細胞、單核細胞以及其他細胞產生的細胞因子。
1994年,Grabstein et al.[2]從猿猴腎上皮細胞系成功分離出IL-15,并把其描述為一個具有類似IL-2生物活性的新的T細胞生長因子;Burton et al.以及Davies et al.[3-4]刺激人T淋巴細胞白血病病毒-1嵌著的白血病細胞系分泌出IL-T細胞因子,后來證實是IL-15。IL-15由單核細胞、巨噬細胞、骨髓間質、樹突狀細胞、角質化細胞及胸腺、腎、皮膚、 腸的上皮細胞產生。IL-15是IL-2細胞因子家族中的一員,具有很多類似IL-2的功能,但其結構與IL-2不相似,在先天和后天獲得性免疫系統中有著重要作用,與骨髓移植、腫瘤、自身免疫性疾病、感染病等相關,并在其中扮演重要的角色[5],且在調控淋巴細胞的功能和穩態中起重要作用。IL-15可作為潛在的淋巴生長因子,給免疫恢復或免疫治療的優化提供一個新的思路。
IL-15通過IL-15Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ鏈組成的IL-15R(IL-15Rα/IL-2Rβ/IL-2Rγ)發揮作用,因此具有與IL-2類似的生物學活性[5]。IL-15是NK細胞發育不可或缺的細胞因子之一,此外還能夠激活成熟的NK細胞、T細胞、B細胞。
近年來隨著分子生物學的蓬勃發展,白細胞介素也得到迅速發展。IL-15是一個多效性的細胞因子,在先天和后天獲得性免疫系統中起著重要的作用,包括免疫性效應細胞(特別是NK、NKT和CD8+T細胞)的發育、激活、尋靶、生存及維持各自的特異性[6-7]。
IL-15在抗炎癥、抗腫瘤、抗感染中起重要的作用[7]。因此,IL- 15在疾病的治療及疫苗佐劑的開發方面具有很大的潛力。本研究基于基因工程技術擴增出ChIL- 15目的基因片段,為后續動物臨床實驗奠定基礎。
1.1 菌株和載體
DH5α感受態菌株為本實驗室保存、pMD18-T(購于大連寶生物有限公司)。
1.2 主要試劑、儀器
RNAisoPlus、TaKaRa TaqTM 試劑盒、 PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒、Bgl II 和 XhoI 限制性內切酶、DNA Marker DL2000、TIANgel Midi Purification Kit試劑盒、E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I試劑盒等均購于TIANGEN。電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技有限公司)、Mastercycler? personal(PCR儀) (美國Bio-rad公司)、DYY-Ⅲ型穩壓電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、 DYY-Ⅲ型電泳槽(北京六一生物科技有限公司)、超凈工作臺(哈東聯公司)、高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)、凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)、恒溫水浴鍋(北京長風儀器儀表有限公司)、恒溫培養箱(北京長風儀器儀表有限公司)、漩渦混合器(北京長風儀器儀表有限公司) 、-20 ℃冷凍冰柜(海爾)、-80 ℃冷凍冰柜(海爾)、4 ℃冷藏冰箱(海爾)。
1.3 實驗動物
山西省忻州種雞場海蘭褐1日齡雛公雞,10只,體重(33±0.1)g。
2.1 總RNA的提取
取雞的脾臟,剪成小塊并立即投入到液氮罐中。取冷凍組織60 mg,樣品按照RNA iso Plus說明書提取操作。取RNA3 μL進行凝膠電泳,檢測RNA的純度;取RNA 2 μL反轉錄測RNA的完整性;取RNA 2 μL進行核酸測定儀檢測其濃度,測定260 nm和280 nm;剩余的RNA保存于液氮罐中備用。
2.2 總RNA的電泳檢測
取RNA 2.5μL與 1μL的上樣緩沖液混勻,進行電泳,停止電泳后在凝膠成像系統中照相。
2.3 引物設計
根據美國國家生物信息中心(NCBI)數據庫GenBank上已發表的雞IL-15基因全序列,利用Prime 5.0軟件設計一對引物,并在其5′端分別引入 Bgl Ⅱ,Xho Ⅰ酶切位點,引物序列為：
p1：GAAGATCTTAACAAGATGCTGGGGATGG(Bgl Ⅱ)
p2：GCCTCGAGTTGCGTATTTTAGTTAGCGT(Xho Ⅰ)
該引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
2.4 雞IL-15基因的PCR擴增
2.4.1 反轉錄
按照反轉錄試劑盒說明書步驟操作進行cDNA第一鏈的合成。
2.4.2 PCR擴增雞IL-15基因
PCR反應在200 μL的PCR管中進行,反應總體系為20 μL,包括上游特異性引物和下游特異性引物各1 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,模板 DNA 1 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加滅菌去離子水補足至20 μL,將反應液震蕩混勻,瞬時離心后置PCR儀上進行擴增。
2.4.3 PCR產物電泳檢測
取PCR擴增產物3 μL與1 μL的緩沖液混勻,進行凝膠電泳,在凝膠成像系統中照相。
2.5 PCR產物的純化回收
按照PCR產物純化試劑盒說明書操作。
2.6 雞IL-15基因與pMD18-T 連接
按照試劑盒說明書操作。
2.7 pMD18-T-ChIL-15的轉化
將轉化后的pMD18-T-ChIL-15菌落進行鑒定。
2.8 pMD18-T-ChIL-15菌落的PCR鑒定
直接挑取LB平板培養基上的白色菌落作為模板進行菌落PCR鑒定。PCR反應在200 μL的PCR管中進行,反應總體系為20 μL,包括上游特異性引物和下游特異性引物各1 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加滅菌去離子水補足至20 μL。
PCR產物進行凝膠電泳檢測,確定陽性克隆菌落。將陽性單克隆菌落用接菌環接取到LB液體培養基中,置于37 ℃,200 rpm恒溫搖床培養8 h以上或過夜,取菌液送經北京華大基因公司進行序列測定。
2.9 pMD18-T-ChIL-15質粒DNA的提取
步驟按新質粒提取omega EZNA plasmid mini kit I試劑盒說明書進行提取操作 pMD18-T-ChIL- 15。
2.10 pMD18-T-ChIL-15質粒的鑒定
2.10.1 pMD18-T-ChIL-15質粒PCR鑒定
PCR反應在200 μL的PCR管中進行,反應總體系為20 μL,包括上游引物和下游引物各1.5 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,模板(pMD18-T-ChIL- 15質粒)1.5 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加滅菌去離子水補足至20 μL。
2.10.2 pMD18-T-ChIL-15質粒雙酶切鑒定
雙酶切體系為20 μL,包括pMD18-T-ChIL- 15 10 μL,Bgl II 1 μL,Xho I 1 μL,10×H Buffer 2 μL,加滅菌去離子水補至20 μL。
2.10.3 pMD18-T-ChIL-15的序列測定
將陽性克隆菌液送北京華大基因公司測序,陽性菌液命名為 pMD18-T-ChIL- 15。
3.1 總RNA的提取結果
取總RNA 2.5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳,結果分別是28 s、18 s和5 s的3條帶(見圖1),檢測總RNA的濃度及純度合格。
圖1-4：雞脾臟總RNA樣品
3.2 PCR結果
以cDNA為模版進行PCR擴增,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳結果約為580 bp,如圖2所示。
1-2：ChIL- 15 的 PCR 產物;3：DNA Marker
3.3 pMD18-T-ChIL-15菌落的PCR鑒定
以pMD18-T-ChIL-15菌落為模版,進行PCR擴增,產物經瓊脂糖凝膠電泳,結果是3、4泳道與預期大小不符,棄3、4泳道菌落,使用1、2泳道的菌落進行大量培養。
3.4 pMD18-T-ChIL- 15質粒鑒定
3.4.1 pMD18-T-ChIL-15質粒PCR鑒定
以質粒為模版進行PCR擴增,產物經瓊脂糖凝膠電泳結果約為580 bp,見圖3。
1-2：質粒 PCR 產物;3：DNA Marker
3.4.2 pMD18-T-ChIL-15的序列測定結果
將陽性克隆菌液送北京華大基因公司進行重組質粒雙鏈DNA的雙向測序,測序后結果表明擴增出ChIL-15的基因全長為581bp。
利用DNAMAN軟件進行比對分析,經序列同源性結果表明：同源性為99.82% ,CDS區內第150個核苷酸發生變異,T變為C(T-C)。
利用 MEGA4.0 軟件進行比對分析,經氨基酸同源性結果表明：同源性為100%。
本試驗成功從雞的脾臟中擴增出ChIL-15,提取的質粒經PCR鑒定、酶切鑒定、測序結果比對及編碼成氨基酸比對均與美國國家生物信息中心(NCBI)數據庫GenBank中登錄號AF139097.1基本相符合,編碼區核苷酸的同源性為99.82%,其中CDS區內150位核苷酸發生變異,由T變為C。進行氨基酸的同源性比對,同源性為100% ,由于密碼子的簡并性,即使密碼子的第三位堿基改變但是不會影響氨基酸翻譯,所以氨基酸的同源性為100%,原因是ACC、ACT都可以編碼為Thr。
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