李勇慧
(洛陽師范學院 生命科學學院,河南 洛陽 471934)
鐵線蓮是毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬(ClematisL.)植物,是一種具有多種抗逆性的藤本植物,且觀賞價值很高,享有“藤本花卉皇后之稱”[1].它不僅具有園藝學價值,可做展覽用切花或用作地被植物[2],同時該屬植物的藥用價值較高,具有抗炎、鎮痛、通淋利尿等作用[3-4].全球已知的鐵線蓮屬植物有350余種[5],國內該屬植物超過140種,主要分布在華中和西南地區,尤其云南最多[6-7].調查顯示,河南有35個類群的鐵線蓮(24個種,1個亞種,10個變種)[2].
隨著分子生物學技術的快速發展,利用分子標記技術研究作物遺傳多樣性及其親緣關系分析的報道也日漸增多.通過不同個體間核苷酸數有所區別的原理準確判斷生物的種內、種間差異,是DNA分子標記技術的顯著特點,且它與環境和發育階段無關,多態性較強,多表現為共顯性[8].其中,簡單重復序列(SSR)標記具有數量豐富、多態性好、信息量高、準確度高等優點[9],該技術是一種用來構建遺傳圖譜、進行品種鑒定、譜系分析和遺傳多樣性分析的有效手段.
SSR技術已應用于研究多種植物的遺傳結構和遺傳多樣性[10-11].熊陽陽等構建了部分鐵線蓮的cDNA文庫,對聚類后得到的Unigene進行功能注釋和同源搜索,查找分析了SSR位點,為鐵線蓮‘薇安’的不同花被類型的差異基因表達、篩選和探究重被花形成的分子機制提供了科學依據[12].陳文超等研究了鐵線蓮屬其他野生品種和栽培品種中11對葉綠體SSR引物的通用性,據此進行cpSSR引物開發,還可以用于檢測鐵線蓮野生種和栽培種之間的遺傳信息,篩選出的cpSSR引物可作為鐵線蓮屬植物系統發育、群體遺傳結構等遺傳信息檢測和研究的有效工具[13].目前尚未有利用SSR技術對不同種質或不同居群的鐵線蓮進行遺傳多樣性分析的研究.因此,本試驗通過SSR標記技術,利用6對引物對25個居群的120個鐵線蓮種質材料進行遺傳多樣性分析,確定不同材料間的遺傳背景差異.
1.1 試驗材料
本試驗選取的材料共25個居群120個樣品,其中包括陜西鐵線蓮(Clematisshensiensis)、大葉鐵線蓮(Clematisheracleifolia)、鈍萼鐵線蓮(Clematispeterae)、尾葉鐵線蓮(Clematisurophylla)、太行鐵線蓮(Clematiskirilowii)、粗齒鐵線蓮(Clematisargentilucida)6種種質資源,具體如表1所示.
表1 樣品及編號
1.2 主要試劑
試驗所用的主要試劑:3 mol/L NaNC溶液,75%乙醇溶液,1×TBE緩沖液,2% CTAB溶液,10%聚丙烯酰胺凝膠母液,TBE,AgNO3,NaOH,甲醛.
1.3 試驗方法
1.3.1 DNA的提取及結果檢測
DNA的提取采用改良的CTAB法[14].用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量,通過超微量分光光度計(凱奧K5500 Plus,北京凱奧科技發展有限公司)進行測定,從中選出濃度與純度較好(濃度在50 ng/mL左右)的DNA,放入冰箱備用.
1.3.2 PCR擴增
取出提取成功的120個DNA樣品,從100對隨機引物中篩選出多態性較好的6對引物進行PCR擴增,擴增完成后于4 ℃冰箱中保存.PCR擴增體系為:正反引物各0.5 μL,ddH2O 3.5 μL,2×pcr mixture 5 μL,DNA模板0.5 μL,總體系共計10.0 μL.鐵線蓮屬SSR擴增程序如表2所示.由于不同引物的Tm值有所不同,退火溫度也有差值,所以需要分批次進行PCR擴增.
表2 鐵線蓮屬SSR擴增程序
1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳
將兩個干凈的玻璃板并齊重疊,一個玻璃板帶耳朵,另一個帶縫隙,將帶縫隙的一面朝里面用夾子固定.按TBE∶瓊脂粉=100 mL∶1 g的配比配制瓊脂糖凝膠溶液,加熱溶解后倒入凝膠槽,放固定好的玻璃板,凝固30 min.然后用玻璃棒將10%的聚丙烯酰胺凝膠工作液引流到玻璃板之間的縫隙,直到沒過,插入梳子,凝固40 min.將玻璃板放入電泳槽中,帶耳朵一側朝里面,取下梳子,點樣.電泳條件:恒壓電壓300 V,電流100 mA,3 h.
1.3.4 銀染檢測
取出玻璃板,將膠完整揭下,清水洗三遍.然后用250 mL 1%的硝酸銀溶液染色10 min,水洗三遍至水清澈無白色渾濁.最后用250 mL顯影液(0.2 g AgNO3,1 g NaOH,2 mL甲醛,純水500 mL)在搖床上顯色10 min.顯示出條帶后,放在膠片觀察燈上觀察,并拍照留檔.
1.3.5 數據統計與分析
2.1 多態性和遺傳多樣性分析
用篩選過的6對引物對25個居群的120個鐵線蓮樣本進行SSR標記擴增,部分擴增圖如圖1所示.6對多態性引物在120個鐵線蓮中檢測到33個等位基因,平均每對引物檢測出5.5個等位基因.用POPGENE1.32軟件計算出的平均等位基因數為2.00,平均有效等位基因數為1.577±0.233,Shan-non信息指數為0.527±0.136,Nei’s基因多樣性指數為0.350±0.113.各引物的PIC值變化范圍在 0.619到0.738之間,平均PIC值為0.638.PIC值在0到1之間,越接近1則多態性越好,反之越差.PIC>0.500時,是高度多態位點,PIC<0.250時,是低度多態位點,0.25 圖1 SSR擴增圖譜 用ACDsee軟件對拍照留檔的照片進行格式轉換,再用Quantity one軟件對多態性條帶進行統計,整理出Excel里的0-1矩陣.用NTSYSpc-2.10e軟件進行分析后得到120個鐵線蓮樣品的UPGMA聚類圖,120個樣品分屬于25個居群(見表1),聚類關系樹狀圖如圖2所示.遺傳相似系數在0.58～1.00之間.遺傳相似系數可以作為分類的依據,在遺傳系數0.68處可以分為三個大類,再以0.77為界又可以將第Ⅰ大類繼續分為四個亞類.Ⅰ-Ⅰ類包括太行鐵線蓮、陜西鐵線蓮和大葉鐵線蓮里的偃師雙龍山(SL-CK)、偃師葦園村(WY-CK)、新鄉萬仙山郭亮村(GL-CK)、新安青要山(QY-CK)、洛陽欒川雞冠山(JG-CS)、洛陽欒川白馬潭(BM-CS)、洛陽龍峪灣南溝(NG-CH)等7個居群.Ⅰ-Ⅱ類包括太行鐵線蓮、陜西鐵線蓮、鈍萼鐵線蓮、大葉鐵線蓮、粗齒鐵線蓮里的偃師葦園村(WY-CK)、萬仙山郭亮村(GL-CK)、新安青要山(QY-CK和QY-CP)、嵩縣臥龍谷(WL-CS)、欒川白馬潭 (BM-CH和BM-CA)、龍門東山石窟(DS-CP)、偃師雙龍山 (SL-CA)等 9個居群.Ⅰ-Ⅲ類包括太行鐵線蓮、粗齒鐵線蓮里的偃師雙龍山(SL-CK)、欒川白馬潭(BM-CA)兩個居群.Ⅰ-Ⅳ類包括太行鐵線蓮、尾葉鐵線蓮、粗齒鐵線蓮和大葉鐵線蓮里的登封嵩山五花坪(WH-CU)、萬仙山郭亮村(GL-CK和GL-CA)、欒川養子溝(YZ-CH)、欒川白馬潭(BM-CH)等5個居群.同時,以0.78為界,第Ⅲ大類分為三個亞類,主要是陜西鐵線蓮和大葉鐵線蓮以及僅有的兩個粗齒鐵線蓮. 圖2 120個鐵線蓮樣本的UPGMA聚類圖 用POPGENE1.32軟件計算出25個居群的鐵線蓮的遺傳相似系數,其范圍在0.59～1.03之間.根據遺傳相似系數,用NTSYSpc-2.10e軟件得到25個居群的UPGMA親緣關系聚類圖(見圖3).在遺傳系數0.74處分成三個大類,第一大類主要包括太行鐵線蓮里的偃師雙龍山(SL-CK)、偃師葦園村(WY-CK)、新安青要山(QY-CK)、偃師萬安山(WA-CK),鈍萼鐵線蓮里的新安青要山(QY-CP)、龍門東山石窟(DS-CP)、洛陽草店村(CD-CP),陜西鐵線蓮里的嵩縣臥龍谷(WL-CS),還有粗齒鐵線蓮里的偃師雙龍山(SL-CA)和欒川白馬潭(BM-CA).第二大類主要包括太行鐵線蓮里的五花坪(WH-CK),粗齒鐵線蓮里的新鄉萬仙山郭亮村(GL-CA),尾葉鐵線蓮里的登封嵩山五花坪(WH-CU).第三大類主要包括太行鐵線蓮里的新鄉萬仙山郭亮村(GL-CK)和距離較遠的陜西鐵線蓮的其余居群,以及所有的大葉鐵線蓮和粗齒鐵線蓮里的龍峪灣雞腳尖(JJ-CA). 圖3 25個鐵線蓮居群的UPGMA聚類圖 利用0-1矩陣通過GenAlex6.5軟件進行鐵線蓮樣品的PCoA分析(如圖4所示).由圖4可知,太行鐵線蓮主要集中在右上部,陜西、粗齒和大葉鐵線蓮大多分布在左下部,尾葉和鈍萼鐵線蓮主要分布在左上和右下部.坐標(coordinate)cood.1和cood.2分別解釋整體遺傳變異的26.21%和46.02%. 圖4 6個種質鐵線蓮的PCoA分析圖 本研究中120個鐵線蓮的PIC值在0.619到0.738之間,其中96號引物的PIC值最高,為0.738,說明這對引物的擴增效率比較強.6對引物共擴增出33條帶,其中96號引物擴增出的條帶最多,為9條,15號只有2條,平均每個擴增出5.5條.在這6對引物中,3對含有二核苷酸重復序列,2對含有四核苷酸重復序列,1對含有六核苷酸重復序列,表明本研究所用的25個居群的鐵線蓮的多態性都比較好,SSR比較適合于鐵線蓮的遺傳多樣性分析. 根據NTSYSpc-2.10e軟件得到120個個體的聚類圖(見圖2).由圖2可知,在大多數情況下,以遺傳相似系數作為分析的依據,同一種質的鐵線蓮會優先聚集在一個大類中,繼而再按照地理位置進行聚類.譬如在第Ⅰ-Ⅰ大類中多是太行鐵線蓮,其中地理位置較近的偃師雙龍山和偃師葦園村會優先聚集在一起.第Ⅲ大類中洛陽欒川養子溝的陜西鐵線蓮和同在欒川養子溝的大葉鐵線蓮優先聚集到一起.這也表明所處位置的地理差異對種群之間的遺傳作用有一定影響.林立等及張杰等的研究也證實了它們的關聯,提出兩者之間是呈正相關的[17-18]. 用POPGENE1.32軟件計算出的25個鐵線蓮居群遺傳相似系數在0.59～1.03之間,平均值為0.77.遺傳相似系數最小的是鈍萼鐵線蓮的洛陽草店村居群和陜西鐵線蓮的新鄉萬仙山南坪居群,這說明這兩個居群親緣關系較遠.遺傳相似系數最大的為陜西鐵線蓮的洛陽汝陽三屯鎮和欒川龍峪灣林場線居群,表明這兩個居群的親緣關系較近. 通過聚類圖(見圖3)可知,大多情況下,同一種的鐵線蓮會優先聚到一大類中,然后同一種內的鐵線蓮基本會按照地理位置的遠近進行聚類,如第一類中的太行鐵線蓮先是距離較近的偃師雙龍山、偃師葦園村、新安青要山、偃師萬安山四個居群聚在一起,然后距離較遠的萬仙山郭亮村單獨聚在第三類中.陜西鐵線蓮在第三類中也是按距離的遠近進行聚類.其他種質也大體上能按距離遠近進行聚類,表明種群間的遺傳距離與地理距離有一定的關系.但萬仙山郭亮村的太行鐵線蓮居群并沒有跟太行鐵線蓮的其他居群聚類到一起,而是跟陜西鐵線蓮的居群聚類到一起,白馬潭的陜西鐵線蓮也沒有和其他陜西鐵線蓮聚在一起,其原因可能是距離較遠或發生了基因交流.Fischer 等的研究也表明了種群內部的基因流會影響居群的遺傳結構[19]. 利用GenAlex6.5軟件進行PCoA分析(見圖4),其結果與UPGMA個體與居群的聚類結果基本一致.Zhou等對Tapisciasinensis進行SSR分析,其PCoA分析結果與UPGMA聚類結果一致[20].可以看到,PCoA圖中太行鐵線蓮主要集中在右上部,與居群第一大類大部分一致,陜西、粗齒和大葉鐵線蓮大多分布在左下部,與居群第三大類接近.尾葉和鈍萼鐵線蓮主要分布在左上和右下部.這些都說明相同種質的鐵線蓮基本上能聚在一起. 本研究利用6對引物對25個居群的120個鐵線蓮進行基于SSR標記的遺傳多樣性分析研究.研究表明,用篩選出來的6對引物對120份鐵線蓮進行的SSR-PCR擴增,共得到33個等位基因,平均每對引物擴增的等位基因數為5.5個,PIC值均大于0.5,說明河南的這6種鐵線蓮具有較高的遺傳多樣性.相同種質的鐵線蓮優先聚在一起,繼而再按照地理位置進行聚類.研究結果可為后續鐵線蓮種質創新和新品種選育提供參考.
2.2 鐵線蓮個體遺傳關系聚類分析
2.3 鐵線蓮居群遺傳關系聚類分析
2.4 鐵線蓮種質的主成分分析
