曾芳 朱小霞 龔蕊 劉傳紅 石德俊 趙玲 楊松
結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，是全球傳染病中的頭號殺手。新型冠狀病毒感染(COVID-19)的大流行扭轉了全球多年來在抗擊結核病方面取得的成效，持續對結核病防控產生破壞性影響。2020年全球新報告結核病患者數約為580萬例，較2019年降幅達18%，登記報告數已倒退至2012年水平，且報告數遠低于實際發病患者數[1]。而最新的《2022年全球結核病報告》指出：2020—2021年期間，結核病的發病率上升了3.6%[2]，扭轉了過去20年內每年下降約2%的趨勢，結核病防治面臨新的挑戰。
肺結核患者是重要的傳染源，早期診斷并及時給予規范抗結核治療，有助于患者及其家庭獲益，對全球結核病防治工作有積極意義。我國“十三五”結核病防治規劃的目標明確要求肺結核病原學陽性診斷率達到50%[3]，這一目標僅靠分枝桿菌痰涂片熒光染色顯微鏡檢查(簡稱“涂片鏡檢”)和分枝桿菌普通培養傳統方法難以實現。分子生物學核酸檢測技術的引入，使肺結核的診斷較以往更加快捷、便利。常用的技術包括GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)和環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術。其中，Xpert因生物安全級別要求較高且價格較昂貴不利于在基層常規開展，而LAMP因操作簡便、耗時少且生物安全級別要求低等諸多優勢，可能更適合基層醫院用于早期診斷，但對二者在無痰/涂陰肺結核患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的檢測研究還不多，鑒于此，本研究通過對此類患者的BALF同時行涂片鏡檢、LAMP和Xpert檢測，以評價LAMP對這類患者的早期診斷價值。
一、研究對象
采用前瞻性研究方法，納入2021年4月至2022年4月重慶市巫山縣人民醫院收治且符合入組標準的232例無痰/痰涂片陰性的疑似肺結核患者為研究對象，所有患者均在支氣管鏡下刷片行抗酸桿菌熒光染色顯微鏡檢查(簡稱“支氣管涂片鏡檢”)，并取BALF行LAMP和Xpert檢測結核分枝桿菌復合群DNA。分析3種方法對本組患者的檢測效能。本研究通過醫院倫理委員會批準[批準文號：2021年倫審第(01)號]，所有研究對象均簽署支氣管鏡檢查知情同意書和臨床研究知情同意書。
納入標準：同時滿足以下3個條件者。(1)符合《WS 288—2017肺結核診斷》標準[4]和《肺結核活動性判斷規范及臨床應用專家共識》[5]診斷標準(不包含Xpert和LAMP檢出結果)中的疑似或臨床診斷患者；
(2)痰抗酸桿菌涂片鏡檢為陰性或無痰；
(3)簽署知情同意書者。
排除標準：(1)有支氣管鏡檢查禁忌證或無法配合支氣管鏡檢查者；
(2)抗酸桿菌痰涂片陽性者；
(3)單純結核性胸膜炎患者；
(4)既往有抗結核治療史者。
二、研究方法
1.支氣管鏡檢查回收BALF：術前完善血常規、凝血功能及心電圖檢查，仔細詢問疾病史，是否合并嚴重心腦血管疾病，是否服用抗凝藥物等，并囑術前禁食水4 h，所有納入患者均進行胸部CT檢查，并根據胸部CT影像學定位，在病變區域進行支氣管鏡檢查。使用注射器吸取10～20 ml生理鹽水后推入目標支氣管內進行灌洗，并借助負壓抽吸生理鹽水，回收約4～6 ml BALF送LAMP和Xpert檢測。
2.分枝桿菌熒光染色鏡檢：在做支氣管鏡檢查的同時，經過纖維支氣管鏡下活檢孔放入支氣管毛刷，在病灶部位刷取脫落細胞，均勻涂制玻片4～6張送檢，行熒光染色顯微鏡檢查。操作步驟及涂片結果判讀遵循《WS 288—2017肺結核診斷》[4]標準中附錄B。
3.BALF的LAMP檢測：取約60 μl BALF加入樣本處理管，90 ℃加熱5 min，經過吸附劑試管處理，添加抽取的30 μl溶液于反應管中，充分混勻后，將反應試管插入LAMP專用恒溫熒光核酸擴增儀[產品型號：LF-160；
生產企業：EIKEN CHEMICAL CO.,LTD；
注冊證號：國食藥監械(進)字 2014 第3402968 號]，在67 ℃反應40 min后進行結果判定。當出現綠色熒光即可判定為陽性，未出現綠色熒光即判定為陰性。
4.BALF的Xpert檢測：取1 ml BALF與標準液混合均勻，室溫下靜置約20 min，取2 ml處理后的樣品置于Cartridge反應盒中，運用Xpert檢測儀進行測定，記錄其結果。所有分子信標探針檢測陽性或1條或多條分子信標探針檢測陰性均判定為陽性(即檢測到結核分枝桿菌)，所有分子信標探針檢測陰性且樣本處理質控陽性即判定為陰性；
根據是否檢測到利福平耐藥記為利福平耐藥或利福平敏感。
三、統計學處理
采用XLSX工作表和SPSS 22.0軟件進行數據的錄入和統計分析。計數資料以“例(百分率，%)”描述，組間差異的比較采用配對χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。以最終臨床診斷為參考標準，評價涂片鏡檢、LAMP和Xpert等檢測方法的檢測效能，包括敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值、診斷符合率、約登指數(指數越大說明真實性越大)等指標。
一、 患者一般情況
研究共納入232例患者，以最終臨床診斷將患者分為無痰/涂陰肺結核患者(139例)和非結核肺病患者(93例)。139例無痰/涂陰肺結核患者中，男性99例(71.2%)、女性40例(28.8%)，年齡范圍為14～79歲，平均年齡為(44.9±18.4)歲；
93例非結核肺病患者中，男性67例(72.0%)、女性26例(28.0%)，年齡范圍為15～79歲，平均年齡為(50.9±14.3)歲，疾病診斷包括肺部感染44例、非活動性肺結核19例、矽肺伴感染12例、慢性阻塞性肺疾病12例、肺腫瘤3例，以及肺膿腫、肺非結核分枝桿菌病和肺血管炎各1例。
二、 三種檢測方法在兩組患者中的檢測結果
LAMP、Xpert和涂片鏡檢對232例疑似肺結核患者的檢測陽性率分別為43.53%(101例)、43.97%(102例)和8.19%(19例)。其中，LAMP和Xpert對139例肺結核患者BALF的檢測結果顯示：二者均陽性者94例，均陰性者32例；
LAMP陽性而Xpert陰性者6例；
LAMP陰性而Xpert陽性者7例。經配對χ2檢驗，兩者差異無統計學意義，即兩種方法檢測一致性良好，具體見表1。
三、三種方法對無痰/涂陰肺結核的檢測效能
以臨床最終診斷為參考標準，3種方法對無痰/涂陰肺結核患者的檢測效能見表2。其中，LAMP和Xpert的檢測特異度均為98.92%、陽性預測值分別為99.01%和99.02%，均與涂片鏡檢結果(均為100.00%)一致；
但LAMP檢測的敏感度、陰性預測值、與診斷一致率和約登指數均與Xpert接近，且均遠高于涂片鏡檢。
表1 LAMP與Xpert對139例無痰/涂陰肺結核患者的檢測結果
表2 三種方法對無痰/涂陰肺結核的檢測效能
世界衛生組織將“與2015年相比，2030年結核病死亡例數減少90%，結核病發病率下降80%”作為“終止結核病策略”的具體目標。要實現如此宏大的目標，需要在研發新診斷技術、新藥核心治療方案及有效的疫苗方面取得重大突破，并全面推廣應用。2017年發布的《WS 196—2017結核病分類》[6]和《WS 288—2017肺結核診斷》[4]修改了肺結核確診患者的條件，即增加了分子生物學檢查結果的應用價值，這是國內首次在行業標準中明確了核酸檢測技術的臨床應用標準。同時，《結核病病原學分子診斷專家共識》[7]也詳細介紹了不同分子診斷技術的原理、各自優缺點，以及各種不同方法檢測結果的解讀。
《2022年全球結核病報告》[2]指出：快速檢測技術的使用目前仍然非常有限，在2021年640萬例新發結核病患者的診斷中，只有38%的患者使用了世界衛生組織推薦的快速分子檢測，略高于2020年的33%和2019年的28%。為積極響應世界衛生組織“終止結核病策略”并努力提高快速分子檢測方法使用率，建議在肺結核診斷工作中應大力推廣各種快速分子檢測手段，以達到早期診斷的目的。我國2021年有57%的患者通過結核病快速診斷，明顯高于全球平均水平(38%)[2]，但這一結果是建立在我國結核病防治項目中免費行Xpert檢測的背景下。作為全球結核病高負擔國家之一，理應繼續全方位加大結核病防治力度以取得更佳的防治效果。目前，國內基層結核病定點醫療機構所用的是多年前免費配置的Xpert檢測儀，主要用于臨床確診患者的免費耐藥篩查，但該試劑成本高、收費昂貴，用于自費診斷時患者接受度普遍低；
同時，基層醫療機構自行添置新的分子診斷儀器的經濟承受力明顯不足，其他分子快速診斷技術的選擇仍然非常有限，因此，加大結核病診斷設備的更新投入，在基層醫療機構大力推廣包括LAMP在內的結核分枝桿菌核酸快速分子診斷技術對我國結核病防控效果具有積極意義。
Xpert是最早應用于結核病診斷的分子生物學檢驗方法，被我國推薦為快速耐藥篩查的首選方法。雖然Xpert技術在檢測結核分枝桿菌時具有較高的敏感度和特異度[8-9]，且生物安全級別要求較高，加之當前尚無國內自主產權的Xpert檢測設備，使得較為昂貴的收費價格在區(縣)級基層醫療機構中難以常規開展。LAMP是另一類的新型分子生物學檢測技術[10]，是一種快速、可靠的結核分枝桿菌診斷方法[11]。由于其基因擴增過程中不需要檢測溫度梯度的循環，僅需在恒定溫度下即可完成擴增，設備自動化程度高。盡管LAMP方法擴增原理復雜，但其操作簡便、耗時少、敏感度高、特異度強，且價格低廉，更適用于各級醫療衛生機構對結核分枝桿菌的快速檢測[12]。
已有研究表明，LAMP和Xpert對不同痰標本中的結核分枝桿菌均有較高檢出率，LAMP在結核感染及涂陰肺結核中也有較高診斷效能[13]，聯合涂片鏡檢法后的診斷效能更高，而檢測BALF中結核分枝桿菌更能明顯提高菌陰肺結核的診斷陽性率，具有較高的診斷價值[14-15]。Yu等[16]發現LAMP對多種臨床標本的檢驗結果均得到肯定的實驗效果。誠然，LAMP在測定結核分枝桿菌DNA時，無論活菌還是死菌均可檢出[17-18]，且臨床可能有內鏡消毒不嚴、標本污染等因素[18]引起假陽性出現，使得臨床需結合抗結核治療史等綜合判斷結核病的活動性。正如本研究中非結核肺病組中的1例LAMP假陽性患者，經補充詢問病史后發現入組前曾有抗結核治療史，考慮其為“死菌”引起。既往研究中，LAMP檢測成人肺結核BALF早期快速診斷的研究較少[19]，考慮到理想的呼吸道檢測標本是提高實驗室檢驗陽性結果的基礎和保障，而BALF可同時進行常規涂片顯微鏡檢查及各種不同方法的核酸檢測[20]，是更為適宜的標本選擇。本研究以BALF為研究材料，以無痰/痰涂片陰性肺結核成人患者為研究對象，結果發現，LAMP檢測疑似無痰/痰涂片陰性肺結核患者BALF的陽性檢出率為43.53%，與賈楓等[21]研究結果(43.57%)一致，說明LAMP檢測無痰/痰涂陰肺結核患者BALF的結果與檢測痰液標本的結果一致，可明顯提高此類患者臨床診斷準確率，為患者早期確診、及時接受規律抗結核治療搶占了先機，對提高治愈率、降低致殘率、遏制家庭及密切接觸范圍內廣泛傳播、利于結核病綜合防治等多方面均具有積極意義；
但支氣管鏡刷檢涂片鏡檢對本組患者的陽性檢出率最低，對非結核肺病患者的陰性檢出率為100.00%，說明涂片鏡檢敏感度差、漏診率高，不適合單獨用于臨床診斷，但其特異度高，可用于結核病的排除。另外，筆者也觀察到LAMP和Xpert檢測無痰/涂陰肺結核BALF的敏感度均遠高于涂片鏡檢，但二者檢測特異度均為98.92%，陽性預測值也均較高，說明LAMP檢測陽性即可確定診斷，但考慮到臨床中存在一定的漏診率，盡管誤診率極低，但當LAMP檢測陰性時仍需要結合其他臨床表現和相關輔助檢查，以及經驗性治療后的反應等多方面綜合判斷。研究還顯示，LAMP和Xpert檢測的約登指數均超過0.7，說明均具有良好的診斷價值，提示臨床可單獨選擇其中任一種作為診斷的檢測方法。
本研究尚有以下值得改進之處：第一，支氣管鏡刷檢涂片鏡檢的陽性率最低，考慮與刷片及留取肺泡灌洗液的標本不一致有關，是研究的缺陷之一，建議在以后可取BALF濃縮離心后進行涂片鏡檢以進一步提高陽性檢出率。第二，本研究限于縣級醫院實驗室條件，未能進一步進行結核分枝桿菌培養和鑒定，但多項研究表明，LAMP檢測的陽性率明顯高于細菌培養的陽性率，且更具耗時短的最大優勢[22-24]，認為結核分枝桿菌以外的其他分枝桿菌的干擾可能微乎其微。
總之，本研究對無痰/涂陰肺結核患者的BALF為檢測樣本行LAMP和Xpert檢測，結果顯示二者均有較高的敏感度和特異度，可明顯提高涂陰肺結核患者的早期分子生物學陽性診斷率，結合其快速、價廉、操作簡便等優點，有利于早期診斷、及時抗結核治療，可在基層結核病定點醫療機構廣泛推廣。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突
作者貢獻曾芳：研究方案總設計、負責課題實施、撰寫文稿；
朱小霞：協助研究方案設計、參與臨床研究、全面收集整理數據；
龔蕊：英文摘要撰寫及修改、統計學處理；
劉傳紅：撰寫及具體操作支氣管鏡檢查及BALF留取；
石德俊：撰寫實驗室檢驗相關內容；
趙玲：全面參與臨床研究及CRF表的填寫和數據收集；
楊松：指導研究方案設計和審閱文稿